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2018 Fiscal Year Annual Research Report

Analysis on the pharmacological mechanism of W9 peptide and development for the novel drug based on the strong potential for chondrocyte differentiation

Research Project

Project/Area Number 18H02918
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

池淵 祐樹  東京大学, 医学部附属病院, 助教 (20645725)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 本間 雅  東京大学, 医学部附属病院, 講師 (60401072)
Project Period (FY) 2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords軟骨細胞 / 軟骨代謝 / W9ペプチド
Outline of Annual Research Achievements

軟骨細胞の初期分化に対して強い促進効果を示すことが確認された、特定の修飾を施したW9ペプチドを用いてプルダウンを行い、W9ペプチドと相互作用している分子の同定を試みた。光応答性のビオチン修飾法、あるいはW9で刺激したマウス軟骨細胞由来ATDC5細胞から粗膜画分を調製してサンプルを濃縮的に回収し、フーリエ変換型の質量分析計を用いてタンパク質の網羅的な同定を行ったところ、W9刺激サンプルで再現性良く検出されるタンパク質が数種類得られた。これらのタンパク質をコードする遺伝子の発現をshRNAを用いて抑制し、その条件下でW9による刺激を行うと、複数の遺伝子の発現抑制下で軟骨細胞の分化が阻害されることが分かった。軟骨細胞の初期分化を促進する作用が知られるTGFb1での刺激に対しては影響を与えないことも確認され、いくつかの分子がW9の結合標的であることが示唆された。
一方で、種々の阻害剤を用いた検討から、W9による軟骨細胞分化作用はTGFb1経路に対する阻害剤で抑制がかかり、W9の標的分子の下流シグナルとTGFb1経路とのクロストークが想定される。様々なシグナル分子のリン酸化状態をウェスタンブロット法、また、より網羅的なリン酸化プロテオミクスの手法で探索を行うと、ERKを始めとした複数のシグナル分子がW9刺激によって活性化することが観察された。今後、これらの詳細を解析することで、非常に強く軟骨細胞の分化を促進するW9ペプチドの作用機序の解明を試みる。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

概ね当初の計画通りに進展している。結合標的分子の同定や細胞内シグナル経路の活性化プロファイルの解析に必要となるプロテオミクス、リン酸化プロテオミクスの手法も構築されており、今後の解析に向けて支障はない。初年度に同定されたW9との結合標的分子候補に関して、その寄与をより厳密に検証するためにCRISPR/Cas9を利用したゲノム編集法の準備も進んでおり、一連の解析を進めることでW9によるシグナル入力機構の解明に繋がることが期待される。
最終的に、物性の問題から全身への投与が困難なW9ペプチドに代わる、その活性を再現したアゴニスト型の抗体分子の開発に関しても、標的分子さえ決定されれば抗体の作出から親和性の改善までの手法はすでに確立できており、当初の計画以上に進捗が得られていると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

初年度での解析で、修飾したW9分子を用いたプルダウンとその相互作用分子群のショットガン・プロテオーム解析による一斉解析により、複数の候補分子がW9ペプチドと結合しうることが確認された。一連の遺伝子をshRNAを用いてノックダウンし、W9ペプチドによる軟骨細胞分化に対する影響を確認したところ、数種類の遺伝子ではW9による作用選択的にその活性が低下することが確認された。本年では、それらの遺伝子の関与をより厳密に検証するため、CRISPR-Cas9を利用したゲノム編集によってマウス軟骨細胞株であるATDC5をホストにノックアウト細胞を樹立し、修飾W9ペプチドによる分化促進作用が完全に消失すること、また当該遺伝子を再導入し、その活性が回復するか否かを検証する。この検証でW9による分化促進作用への関与が確認された場合には、やはりCRISPR-Cas9でのKOマウスの作出を行い、in vivoでの表現型解析を計画する。
また、W9による結合標的分子が複数にまたがる可能性も想定しており、特定の分子をハブとして複合的なシグナルソームを形成している場合には、上記の検証のみではW9の作用機序解明が十分に達成できない。試薬存在下で多量体を形成可能なタグ配列を利用し、W9結合分子候補の細胞外領域にこれらを付与したキメラ遺伝子を発現させたATDC5細胞を試薬で刺激し、W9と同様の分化促進が観察される組み合わせを探索する。同時に、異なる分子を同時に認識可能なバイスペシフィック型抗体等も作成を進め、同様の検討を実施する。

  • Research Products

    (12 results)

All 2019 2018 Other

All Journal Article (4 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 3 results) Presentation (7 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] The induction of RANKL molecule clustering could stimulate early osteoblast differentiation2019

    • Author(s)
      Sone Eri、Noshiro Daisuke、Ikebuchi Yuki、Nakagawa Mami、Khan Masud、Tamura Yukihiko、Ikeda Masaomi、Oki Meiko、Murali Ramachandran、Fujimori Toshihiko、Yoda Tetsuya、Honma Masashi、Suzuki Hiroshi、Ando Toshio、Aoki Kazuhiro
    • Journal Title

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 509 Pages: 435~440

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2018.12.093

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Coupling of bone resorption and formation by RANKL reverse signalling2018

    • Author(s)
      Ikebuchi Yuki、Aoki Shigeki、Honma Masashi、Hayashi Madoka、Sugamori Yasutaka、Khan Masud、Kariya Yoshiaki、Kato Genki、Tabata Yasuhiko、Penninger Josef M.、Udagawa Nobuyuki、Aoki Kazuhiro、Suzuki Hiroshi
    • Journal Title

      Nature

      Volume: 561 Pages: 195~200

    • DOI

      10.1038/s41586-018-0482-7

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] RANKL結合ペプチドによる骨形成促進メカニズムの検討2018

    • Author(s)
      曽根絵梨、Masud Khan、能代大輔、池淵祐樹、本間雅、田村幸彦、菅森泰隆、鈴木洋史、宇田川信之、青木和宏
    • Journal Title

      日本骨形態計測学会雑誌

      Volume: 28 Pages: S158

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] RANKL逆シグナルによる骨吸収と骨形成の共役2018

    • Author(s)
      本間雅、池淵祐樹
    • Journal Title

      ライフサイエンス新着論文レビュー First Author's

      Volume: - Pages: -

    • DOI

      10.7875/first.author.2018.095

  • [Presentation] 関節リウマチに関する新規バイオロジクスの創製検討2018

    • Author(s)
      藏田玲美、本間雅、池淵祐樹、苅谷嘉明、鈴木洋史
    • Organizer
      日本薬剤学会第33年会
  • [Presentation] A stimulatory mechanism of RANKL-binding peptide on osteoblast differentiation2018

    • Author(s)
      Sone, E.、Noshiro, D.、Ikebuchi, Y.、Khan, M.、Sugamori, Y.、Tamura, Y.、Yoda, T.、Honma, M.、Aoki, K.
    • Organizer
      32nd IADR Southeast Asian Division Annual Meeting
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 骨芽細胞に発現するRANKLはカップリング・シグナルを受容する2018

    • Author(s)
      池淵祐樹、本間雅、苅谷嘉明、鈴木洋史
    • Organizer
      第40回 生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • [Presentation] Osteoblastic RANKL acts as an osteogenic signal acceptor recognizing vesicular RANK secreted from osteoclasts2018

    • Author(s)
      Honma, M.、Ikebuchi, Y.、Suzuki, H.
    • Organizer
      ASEMV 2018 Annual Meeting
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Osteoblastic RANKL acts as an osteogenic signal acceptor for vesicular RANK derived from maturing osteoclasts.2018

    • Author(s)
      Honma, M.、Ikebuchi, Y.、Kariya, Y.、Suzuki, H.
    • Organizer
      AAPS PharmSci 360
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Development of a novel chimeric protein construct aiming to improve therapeutic efficacy against rheumatoid arthritis2018

    • Author(s)
      Kurata, R.、Honma, M.、Ikebuchi, Y.、Kariya, Y.、Suzuki, H.
    • Organizer
      AAPS PharmSci 360
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] RANKL逆シグナルによる骨吸収と骨形成のカップリング2018

    • Author(s)
      池淵祐樹
    • Organizer
      第21回 骨代謝研究会
  • [Remarks] 東京大学医学部附属病院薬剤部試験研究室/臨床薬物動態学教室

    • URL

      https://plaza.umin.ac.jp/~todaiyak/

URL: 

Published: 2019-12-27  

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