2019 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis on the pharmacological mechanism of W9 peptide and development for the novel drug based on the strong potential for chondrocyte differentiation
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18H02918
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
池淵 祐樹 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (20645725)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
本間 雅 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (60401072)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 軟骨細胞 / 軟骨代謝 / W9ペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
W9ペプチドによる軟骨細胞の強力な分化促進作用の起点となる、細胞膜表面に発現する結合標的分子の探索を進めている。これまでに、（1）ビオチン修飾を施したW9ペプチドをマウス軟骨細胞ATDC5に暴露し、一定時間後に回収したW9結合分画に含まれる細胞膜タンパク質をショットガン・プロテオーム解析によって同定し、（2）shRNAによる遺伝子抑制、もしくは中和抗体によってW9の作用が減弱するかを条件に、10種類程度の候補分子が確認されている。ただし、（2）での抑制効果が単独の遺伝子で完全には認められない場合もあることから、（3）2での条件下で再度プロテオーム解析を行い、複数分子間でのシグナル複合体の形成について検証を実施している。また、同定されている候補分子に関しては、（4）CRISPR-Cas9を利用したゲノム編集により遺伝子を欠損させたATDC5細胞が取得できており、W9による作用が影響を受けるか否か、引き続き検証を進める。
W9ペプチドの作用機序の解明と並行して、強い軟骨細胞分化促進作用を再現できる刺激剤の開発を試みている。前述の解析から同定された分子間を繋ぐバイスペシフィック型の抗体を創製するため、最初に、各分子の細胞外領域を認識する短鎖可変領域（scFv）をファージディスプレイ法によってスクリーニングしている。結合親和性の高いscFv配列が決定できた後に、それらを組み合わせたバイスペシフィック型抗体を作出し、in vitroおよびin vivoでの検証を予定している。また、W9ペプチド自体の分子安定性・可溶性の改善から目的が実現できないか、PEGの修飾などでの検討を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた研究計画とは一部流れを変更している部分もあるが、概ね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
W9ペプチドと結合しうる軟骨細胞表面に発現するタンパク質が複数同定されており、この点のさらなる検証のため、CRISPR-Cas9システムで各遺伝子をノックアウトした細胞を樹立しており、まずはこれらの細胞のW9ペプチドへの応答性を検証する。また 、この際に軟骨細胞内でどのようなシグナル経路の活性化・抑制が生じているのか、リン酸化プロテオーム解析によって網羅的な検証を試みる 。阻害剤を用いた種々の検討から、p38や複数の経路の活性化が軟骨細胞の誘導に関わっていることが示唆されており、これらのバランスの変化が本研究で着目する強力な分化促進効果を生じさせていると想定される。
また、W9の強い分化促進活性をミミックでき、かつin vivo等での評価により取り扱いの容易な刺激剤の開発を引き続き試みる。具体的には、W9ペプチドとの結合が想定される細胞膜上の分子に関して、細胞外領域を抗体等で架橋することで空間的に近傍に配置させ、シグナルソームのような複合体を形成することで分化誘導シグナルを生じさせることを試みる。予検討として、試薬存在下で多量体を形成可能なタグ配列を利用し、これらの細胞外領域に付与したキメラ遺伝子を軟骨細胞に発現させた検討を行なっており、一定の効果が確認されている。恒常発現株の取得なども検討しつつ最終的な候補を絞り、ファージディスプレイ法による抗体の取得・最適化を進める。得られた抗体は、軟骨細胞を用いたin vitroでの解析から活性を検証し、有効な数種類に絞ってマウスin vivoでの解析を実施する。軟骨再生を評価する実験モデルとしては、モノヨード酢酸投与による変形性関節炎モデルが確立されており、抗体の投与による運動量の変化、また関節標本での骨・軟骨組織への影響を観察する。
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