2020 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis on the pharmacological mechanism of W9 peptide and development for the novel drug based on the strong potential for chondrocyte differentiation
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18H02918
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
池淵 祐樹 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (20645725)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
本間 雅 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (60401072)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 軟骨代謝 / W9ペプチド / 細胞内シグナル / 抗体創薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
W9ペプチドの結合標的候補となるいくつかの遺伝子に関して、CRISPR-Cas9システムを用いて遺伝子欠損させたモデル細胞を複数作出し、W9ペプチドへの応答性の変化を検証した。shRNAを用いた一過性のノックダウン実験と同様に、数種の遺伝子欠損によって、W9ペプチドの持つ軟骨細胞分化促進作用が大きく減弱する様子が確認され、複数の経路が関与する相加的、あるいは相乗的な作用機序が想定されている。また、これらの細胞系を使用したリン酸化プロテオーム解析を行なった。軟骨細胞分化に寄与することが知られているSMAD2/3に加えて、いくつか特徴的に変動するシグナル経路が観察されており、これらのシグナル経路の変動がどのように軟骨細胞分化に関わっているのか、さらに検証を行なっている。
また、これらのW9ペプチドによる誘導作用機序の解明と並行して、この活性をミミックした、in vivo等での評価に取り扱いの容易な刺激剤の開発を試みている。これまでの検討から複数の抗体認識部位を持つ改変抗体の構造最適化はほぼ完了しており、さらにリンカーの配列や繰り返し回数などの基本骨格は数パターンまで決定されている。これを基盤として、上述の候補遺伝子に対する抗体可変領域を組み込んた改変抗体を作出し、in vitroでの活性評価を行った。マウス軟骨細胞様ATDC5細胞に対して、これらの抗体改変分子で刺激を行うと、一部の組み合わせでは軟骨細胞の分化状態を反映するCol2、Aggrecan遺伝子の変動が認められた。さらに、有効と考えられた数種類に関しては、マウスin vivoでの解析を進めている。モノヨード酢酸投与による変形性関節炎モデルを用いて、抗体の投与による運動量の変化、また関節標本での骨・軟骨組織への影響を観察する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画通り、W9ペプチドの結合標的となる細胞膜表面に発現する複数の候補タンパク質が挙げられており、CRISPR-Cas9等の手法を用いて同定を試みているが、単一の分子ではなく複数分子の複合体へと作用している可能性を示唆する結果が得られており、計画からやや遅れが出ている。
しかしながら、最終的に目標とする、W9ペプチドの活性をミミックした抗体様分子の作出に関しては、基本的な構造等の最適化がほぼ完了しており、W9ペプチドの結合分子が選抜でき次第、予定する検証は実施可能だと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの検討に引き続き、W9ペプチドの結合標的候補となるいくつかの遺伝子に関して、CRISPR-Cas9システムを用いて遺伝子欠損させたモデル細胞を複数作出することでW9ペプチドへの応答性の変化を検証する。また、これらの細胞系を使用したリン酸化プロテオーム解析を行い、W9ペプチドの刺激によって特徴的に変動する細胞内シグナル経路を探索する。
さらに、W9ペプチドによる軟骨細胞の誘導作用機序の解明と並行して、この強い軟骨細胞分化作用を示す、in vivo等での評価に取り扱いの容易な刺激剤の開発を試みる。これまでの検討から最適化された改変抗体の構造・リンカー部分の配列や長さなどの情報を基盤として、上述の候補遺伝子に対する抗体可変領域を組み込んた改変抗体を作出し、in vitro・vivoでの活性評価を行う。マウス軟骨細胞様ATDC5細胞、および、マウスへのモノヨード酢酸投与による変形性関節炎モデルを用いて種々の活性を評価する。
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