2018 Fiscal Year Annual Research Report
The study for ATP biosynthesis in skeletal development and skeletal disorders
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18H02922
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
秋山 治彦 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 教授 (60402830)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河村 真吾 岐阜大学, 医学部附属病院, 助教 (30456511)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 骨格形成 / ミトコンドリア / ATP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1)Tfamコンディショナルノックアウト遺伝子改変マウスを用いた解析
Prx1-Creトランスジェニックマウスを用いてTfam遺伝子を未分化間葉系細胞特異的に欠失させたコンディショナルノックアウトマウスの結果から、ミトコンドリアにおける好気性ATP産生が骨格形成と正常な骨格維持に重要であることが明らかにした。これらの結果から好気性ATP産生の抑制が骨格形成の骨形成および軟骨形成段階で必須であることが明らかとなった。
2)骨軟骨培養細胞を用いたin vitro解析
初代軟骨細胞及び骨芽細胞及びATDC5細胞、MC3T3-E1細胞を用いてミトコンドリアにおける好気性ATP産生能を分化段階ごとに解析した。細胞を分化培養液で培養し、各分化段階ごとに細胞内ATP濃度、ミトコンドリアDNA量、乳酸量を定量した。次に各分化段階の細胞にミトコンドリアATP産生阻害物質であるロテノンを投与し、細胞増殖活性、アポトーシスを解析し、Sox9, Col2a1, Col10a1,Ihh, PTHrP受容体,Col1a1, Osteocalcin, Runx2など骨軟骨細胞に発現している遺伝子発現レベル、骨軟骨細胞における低酸素状態関連遺伝子HIFおよびAMPK遺伝子発現の変化を解析した。さらにロテノンによる軟骨細胞表現系の変化がAMPK活性化剤AICAR及びA-769662でレスキューされるかどうかを検討した。以上から、培養細胞を用いた細胞レベルにおいても好気性ATP産生の抑制が骨格形成の骨形成および軟骨形成段階で必須であることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
すべての実験が概ね順調に経過している。
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| Strategy for Future Research Activity |
骨格形成における嫌気性ATP生合成経路の機能解明
1)乳酸脱水素酵素A(LDHA)コンディショナルノックアウト遺伝子改変マウスを用いた解析（秋山、河村）
嫌気性解糖系におけるATP産生は,ピルビン酸がLDHAにより乳酸に変化する反応による。本研究ではLDHA floxアレルを有するコンディショナルノックアウト遺伝子改変マウス作製する。この遺伝子改変マウスとPrx1-Creトランスジェニックマウス、Col2a1-Creトランスジェニックマウス、Col10a1-Creノックインマウス、Col1a1-Creトランスジェニックマウスを交配し骨格形成過程の各段階でLDHA遺伝子を欠失させ、それぞれの骨格表現系をskeletal preparation、組織学的解析、in situ hybridizationによる遺伝子発現解析で明らかにする。これらの結果から嫌気性ATP産生の抑制が骨格形成のどの段階でどのように必須であるかを詳細に解明する。
2)初代軟骨細胞及び骨芽細胞を用いてミトコンドリアにおける嫌気性ATP産生能を分化段階ごとに解析する。細胞を分化培養液で培養し、各分化段階ごとに細胞内ATP濃度、ミトコンドリアDNA量、乳酸量を定量する。次に各分化段階の細胞にLDHA阻害物質であるGKS2837808Aを投与し、細胞増殖活性、アポトーシスを解析し、Sox9, Col2a1, Col10a1,Ihh, PTHrP受容体,Col1a1, Osteocalcin, Runx2など骨軟骨細胞に発現している遺伝子発現レベル、骨軟骨細胞における低酸素状態関連遺伝子HIFおよびAMPK遺伝子発現の変化を解析する。さらにGKS2837808Aによる軟骨細胞表現系の変化がAMPK活性化剤AICAR及びA-769662でレスキューされるかどうかを検討する。
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