2019 Fiscal Year Annual Research Report
腎細胞癌の免疫環境と血管新生阻害後のリモデリングの統合的解析による新規治療の開発
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18H02939
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
大家 基嗣 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (00213885)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三上 修治 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (20338180)
小坂 威雄 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (30445407)
水野 隆一 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (60383824)
田中 伸之 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (60445244)
浅沼 宏 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (70245570)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 腎細胞癌 / 分子標的治療 / 血管新生 / 耐性 / 免疫治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腎がんは免疫療法：抗PD-1/PD-L1療法の先駆的立場にあり、本研究の知見は全てのがん治療に波及効果を持つ。免疫療法では、未だ正確な薬剤効果・副作用を予測するバイオマーカーが不足している。多様な細胞が同時に混在するがん免疫微小環境を1細胞レベルで解明することは、免疫療法の個別化医療を達成する上で欠かせない。本研究で我々は、腎がん臨床組織の大規模な免疫組織学的解析に加え、最新のライトシート顕微鏡・シングルセルRNAシークエンス・血液循環腫瘍細胞を利用し、腎がん免疫微小環境を克服する1細胞解析の実装を目標としている。2019年度は、当教室の世界的な腎がんデータベースから作成した組織マイクロアレイを利用し、免疫組織染色・自動シングルセルカウントによる大規模解析を実施した。本組織マイクロアレイは淡明型の原発・転移巣に留まらず、乳頭型・嫌色素型に加えて、肉腫様型や転座型も網羅する。独自に作成した評価パネルを用いることにより、計10,000スポット以上の腎がん組織が免疫組織学的に1細胞解析され、遺伝子変異情報と組み合わせることで、包括的な腎がん免疫ゲノミクスが明らかとなった。本評価パネルには、獲得免疫のみならず自然免疫も網羅されており、このようなビックデータでの自然・獲得免疫に及ぶがん免疫微小環境の解明は、他癌種においても類をみない。ライトシート顕微鏡においては、前年度同様に、腎腫瘍塊に存在する3次元血管網の解析が進められた。シングルセルRNAシークエンス・血液循環腫瘍細胞を用いた解析も、前年度に引き続きプロトコール改良を行った。特にシングルセルRNAシークエンスでは、マウス腫瘍塊から癌細胞・免疫細胞を同時に1細胞単離するプロトコールの改良が行われ、細胞生存能力を維持した状態でシークエンス前の単一細胞化が可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度は、前年度に作成された組織マイクロアレイを利用し、腎がん免疫微小環境を解析した。本組織マイクロアレイは淡明型の原発・転移巣に留まらず、乳頭型・嫌色素型に加えて、肉腫様型や転座型も含まれる。さらに、泌尿器科病理医との共同で、腎がん腫瘍中心やinvasive marginが全ての症例で網羅される（承認番号:20180098）。独自に作成した評価パネルを用いることで、免疫組織染色における特異性が担保され、自然免疫から獲得免疫に及ぶ包括的ながん免疫微小環境を可視化した。染色切片をデジタル画像化し、自動カウントする解析プラットフォームを導入することで、ハイスループットな1細胞解析が可能となり、腫瘍中心やinvasive marginの空間情報を併せ持つ、計10,000スポット以上の腎がん組織が免疫組織学的に1細胞解析された。腫瘍DNAを用いたターゲットシークエンス（承認番号: 20190059）では、腎がんに特徴的な遺伝子変異情報が検出され、免疫微小環境情報との統合は、腎がん免疫ゲノミクスを明らかにした。ライトシート顕微鏡においては、前年度同様に、腎腫瘍塊に存在する3次元血管網の解析が進められた。ライトシート顕微鏡による癌組織の可視化は、1細胞レベルの解像度で立体的に再現される。不均一ながん免疫微小環境の空間解析には欠かせない。また、シングルセルRNAシークエンス・血液循環腫瘍細胞（承認番号:20180099）を用いた解析も、前年度に引き続きプロトコール改良が行われ、特にシングルセルRNAシークエンスでは、マウス腫瘍塊から癌細胞・免疫細胞を同時に1細胞単離するプロトコールの開発・改良に多くの時間を有した。最終的に、細胞生存能力を維持した状態でシークエンス前の単一細胞化が可能となった。血液循環腫瘍細胞の解析は、症例を引き続き集積中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
2018-9年度の成果で得られた腎がん組織マイクロアレイは、世界的規模を有する。特に泌尿器科病理医との共同は、腎がん腫瘍中心やinvasive marginを含んだ組織マイクロアレイ作成を可能にし、腫瘍における位置情報を含んだ腎がん免疫微小環境の解析プラットフォームが世界で初めて完成された。2019年度は、計10,000スポット以上の腎がん組織を、免疫染色後にバーチャルスキャナーでデジタル画像化し、自動セルカウントで解析した。包括的な腎がん免疫微小環境の可視化は、がん薬剤耐性を解決する糸口として欠かせない。次年度は計画の最終年度であり、腫瘍DNAを用いたターゲットシークエンスで得られた遺伝子変異情報に加えて、網羅的なDNAメチル化解析データを併せ持つ、「腎がん免疫ゲノミクス」のビックデータ解析を予定する。また、我々の独自性であるライトシート顕微鏡は、これまでの成果で3次元免疫染色・透明化プロトコールが腎がん組織で最適化された。現在、腎腫瘍塊に存在する3次元血管網の解析を順次進めており、今後も症例の蓄積を継続する。さらに、立体的な腫瘍塊を用いた独自の3次元in situハイブリダイゼーション法にも着手しており、得られるデータは不均一ながん免疫微小環境の空間解析に利用する予定である。腎がんで喫緊な免疫療法：PD1/PDL1療法の耐性克服に繋がる分子基盤の解明には、癌細胞から宿主免疫細胞を網羅する1細胞トランスクリプトーム解析、すなわちシングルセルRNAシークエンスが欠かせない。次年度は本研究手法に関しても、これまで開発・改良を行ってきた単一細胞化プロトコールを駆使し、血液循環腫瘍細胞と共に1細胞解析を順次進める予定である。最終的には、1細胞解析結果を立体的な腫瘍にライトシート顕微鏡でマッピングし、特定の細胞ニッチ詳細を3次元で可視化する解析プラットフォームの確立を目指す。
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