2018 Fiscal Year Annual Research Report
Fluorescent imaging and analysis of molecular biological properties of the cells that contribute to the integration of the skeletal components
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18H02966
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
宿南 知佐 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 教授 (60303905)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
谷本 幸太郎 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 教授 (20322240)
三浦 重徳 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (70511244)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 靭帯 / 縫合部 / 歯根 / Scleraxis / Sox9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ScxTomato Transgenic (Tg)マウスとSox9GFP knock-inマウスを交配し、得られたScxTomato;Sox9GFPマウス胚を用いてScx+細胞、Scx+/Sox9+細胞、Sox9+細胞を可視化した。ScxTomato;Sox9GFPマウス胚を4%パラフォルムアルデヒドにて1時間あるいはOvernightで固定して、深部構造を観察するために、60% 2,2'-チオジエタノールによって透明化した。蛍光実体顕微鏡観察下で観察したところ、15.5日胚までは、透明化しないものよりも、深部構造の観察が良好に行えたが、16.5日胚では、血管網の存在によって、透明化しても観察が困難で、別の透明化試薬であるCubicの方が有効であった。また、多光子励起顕微鏡を用いて、14.5日胚では、指節間関節、耳小骨・顎関節形成領域にてScx+/Sox9+細胞を観察した。凍結切片を用いた解析においても、同様の結果が得られている。椎間板の外線維輪では、Scx、Sox9だけでなくPax1/9が発現しているが、Sox9によるAggrecanの発現レベルの制御は、Pax1/9によって調節されていることが明らかになった。RNA Seqによる解析に向けて、Scx+細胞、Scx+/Sox9+細胞、Sox9+細胞を分離するための条件を、セルソーターとレーザーマイクロダイセクションシステムにて、検討中である。野生型マウスとScx欠失マウスの頭蓋縫合部、顎関節、歯根部形成過程を解析し、Scxの欠失による石灰化亢進、歯根の低形成などを見出している。Scx欠失マウスと野生型マウスのRNA Seq解析では、追加のRNAを抽出したので、データ数を増やした後に、Real time PCRやin situ hybridizationによる検証を行い、機能解析を進める遺伝子を決定する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた実験を行い、次年度に向けて必要な情報を収集することが出来ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ScxTomato;Sox9GFPマウスの透明化に必要な条件を、胚だけでなく生後のマウスにおいても検討し、多光子励起顕微鏡による解析を進める。また、ScxTomato;Sox9GFPマウス胚からのScx+細胞、Scx+/Sox9+細胞、Sox9+細胞を分離の条件を最適化することにより、RNA Seqを用いた細胞特性の解析を進める。
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