2019 Fiscal Year Annual Research Report
Fluorescent imaging and analysis of molecular biological properties of the cells that contribute to the integration of the skeletal components
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18H02966
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
宿南 知佐 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (60303905)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
谷本 幸太郎 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (20322240)
三浦 重徳 東京大学, 生産技術研究所, 特任講師 (70511244)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 靱帯 / 縫合部 / 歯根 / Scleraxis / Sox9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Sox9GFP knock-inマウスとScxTomatoマウスを交配して得たScxTomato;Sox9GFPマウス胚を用いて、多光子励起顕微鏡による深部構造の解析をさらに進めた。最初に検討していた60%チオジエタノールよりも、CUBIC-L/Rを用いた透明化の方が有効であることが明らかになっているので、本年度は、CUBIC-L/Rを用いてマウス胚の透明化処理を行った。胎生14.5日のScxTomato;Sox9GFPマウス胚の前肢部における軟骨・腱・靱帯形成過程の可視化や胎生16.5日のScxTomato;Sox9GFPマウス胚の顎関節領域、メッケル軟骨、耳小骨のイメージングに成功している。同時に、赤色蛍光と緑色蛍光による検出だけでなく、SHGイメージングによるコラーゲン形成過程の可視化も行った。さらに、胎生13.5日、胎生14.5日、胎生15.5日、胎生18.5日のScxTomato;Sox9GFPマウス胚の顎関領域を凍結薄切切片によって解析し、顎関節の形成過程におけるScx+、Scx+/Sox9+、Sox9+のダイナミックな局在変化を明らかにした。Scx欠失によって変動する遺伝子の発現変化を、in situ hybridizationによって検証した。ScxGFPレポーターマウスから樹立したScxGFP iPS細胞を用いた腱・靱帯分化誘導系の構築にも成功した。胎生13.5日のScxTomato;Sox9GFPマウス胚と新生仔からそれぞれ線維芽細胞を分離培養し、Scx+、Scx+/Sox9+、Sox9+の発現変化を解析した。in vitroの系を用いて、Scx欠失によって変動する遺伝子の機能解析に向けた準備を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた実験を行い、最終年度に向けて必要な情報を収集することが出来ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
透明化ScxTomato;Sox9GFPマウスを用いた深部解析を、更に進める。また、ScxGFP iPS細胞を用いた腱・靱帯分化誘導系を活用して、single cell levelでのRNA Seq解析を行う。
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