2019 Fiscal Year Annual Research Report
Regeneration of dentin-pulp complex from iPS cells using new odontoblasts differentiation mechanism and polarity regulation
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18H02984
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
原田 英光 岩手医科大学, 歯学部, 教授 (70271210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大津 圭史 岩手医科大学, 歯学部, 准教授 (60509066)
横山 拓矢 岩手医科大学, 医学部, 講師 (70772094)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 再生 / 象牙質歯髄複合体 / iPS / Copine-7 / Semaphorin |
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| Outline of Annual Research Achievements |
iPS細胞から歯原性間葉系幹細胞を分化誘導する技術に新たな分子機構で分化誘導能を示すCopine-7と細胞極性を制御するSemaphorin4D(Sema4D)を応用して，ヒトiPS細胞（hiPS）から象牙質・歯髄複合体形成を誘導する技術を開発する。hiPSから分化誘導した神経堤様細胞（NCLC）あるいは間葉系幹細胞(MSC)に対してリコンビナントヒトCopine-7(hCPNE7)あるいはhCPNE7発現HAT7（ラットエナメル芽細胞株）のコンディション培地を作用させる実験を行った。その結果，象牙芽細胞の分化マーカー(DSPP)の発現を免疫組織学的に確認した。そこでNCLCに対してCPNE7の効果を検証するため，歯髄細胞の分化マーカーであるDMP，Pax9, Lhx6の発現についても検討した結果，hCpne7はこれらのマーカーを有意に上昇させることが示された。さらにNCLCに対して転写因子Pax9を強発現させるとDSPPの発現が上昇した。以上の結果から，ｈCPNE7はPax9の発現を誘導してDSPPの発現を誘導することもまた明らかとなった。さらにhCPNE7発現エナメル上皮細胞株オルガノイドとNCLCオルガノイドを結合させる実験を行ったが，マウスとヒトオルガノイドは最終的には結合せずに器官発生へ誘導は成功しなかった。現在iPS由来ヒト上皮細胞の作製を行い，この細胞による上皮細胞オルガノイドの作製を試みている。一方，さらにこの2つのオルガノイドとiPS由来NCLCオルガノイドを結合させた共培養を行い，iPS細胞から象牙芽細胞への分化誘導オルガノイドの作製とSCIDマウス移植による実験を現在進めているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
hiPSから分化誘導した神経堤様細胞（NCLC）に対してリコンビナントヒト Copine-7(h CPNE7)を作用させる実験を行った結果，NCLCあるいはNCLC由来間葉系幹細胞の培地中にhCPNE7を添加することで象牙芽細胞の分化マーカー(DSPP, DMP, Pax9, Lhx6)の発現を誘導できた。hCPNE7はPax9の転写因子の発現を誘導することも明らかとなり，Pax9を介したｈiPSからの象牙芽細胞分化誘導も再現することができた。さらに，Pax9の強制発現でhiPSからDSPPの発現誘導やリコンビナントｈCPNE7徐放性コラーゲンスポンジを用いた象牙芽細胞分化誘導，歯髄再生3Dモデルにも概ね成功した。一方，マウス上皮オルガノイドとhiPS由来間葉系幹細胞オルガノイドの結合はいまのところ成功していない。また象牙芽細胞の極性制御による歯髄組織構築は未だ実現できていない。基本的分化誘導については概ね予定どおりに成功しており，今後上皮組織側の再生もhiPS細胞由来で作製することで，上皮間葉の再結合による象牙質歯髄複合体の再生を目指す。さらにオルガノイド培養や上皮間葉の再結合，歯胚再生に関しての実験も進めている。今年度の成果によって，新規器官培養法の開発，象牙質歯髄複合体の3Dモデルについても期待できるところまできたと考えられ，概ね順調であると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
象牙質歯髄複合体の再生には細胞極性を制御する技術開発も重要であり，2020年度ではSema4D(4A)あるいはLPA(別のRhoシグナル活性化因子)を用いた象牙芽細胞の極性制御に関する実験をさらに継続する。hiPS由来エナメル上皮細胞にSema4Dの発現ベクターあるいはLPA合成酵素の発現ベクターを導入した細胞株を作製する。さらにCPNE7とSema4Dの両発現ベクターを用いたhiPS由来エナメル上皮細胞の新規細胞株を作り，さらにこれらの細胞とNCLCとを組み合わせた３Dオルガノイドの形成を試みることでより精巧な象牙質―歯髄複合体形成に取り組んでいく。このオルガノイドとiPS細胞由来NCLCあるいは間葉系幹細胞，象牙芽細胞などのオルガノイドと共培養して3D化した象牙芽細胞形成を試みる。この組織切片での象牙芽細胞の極性発現，基質形成，石灰化などについて解析を行う予定である。３Dでもしうまくいかない場合は，細胞シート形成法にてこれらの細胞の積層実験から細胞の極性や基質分泌，石灰化などを検討する予定である。これらの複合体をさらにヌードマウスの腎被膜下に移植して生体組織中で象牙質―歯髄複合体の形成が行われるかについて検討を行う。これらの研究成果は最終的にウシやブタなどの歯に対してこれらの細胞複合体を適応し，ヌードマウスの皮下にて象牙質歯髄複合体の再生が可能であるかを検証したいと考えている。
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Research Products
(13 results)
