2018 Fiscal Year Annual Research Report
Formation and repair mechanisms of radiation-induced DNA-protein cross-links
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18H03374
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
井出 博 広島大学, 理学研究科, 教授 (30223126)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平山 亮一 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 放射線医学総合研究所 重粒子線治療研究部, 主任研究員(定常) (90435701)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 放射線 / DNA損傷 / 修復機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
放射線が誘発するDNA-タンパク質クロスリンク（DPC）は，生成の絶対量や修復動態が分かっていないため，他の損傷に比べ放射線誘発損傷としての位置づけが明確ではない。研究代表者は，最近の研究でX線によるDPC生成量が塩基損傷やDNA一本鎖切断に匹敵することを示した。さらに，隣接する鎖切断の違いにより三つのタイプのDPC（Type 1～Type 3）が生成することを明らかにした。本研究では，これら三つのタイプのD PCの生成機構および修復を調べ，DNA二本鎖切断に次ぐ第二の主要放射線誘発致死損傷としてのDPCの位置づけを明らかにする。
DPC生成機構：放射線が誘発するラジカルの非特異的な再結合（非特異的反応）により生成するType 1 DPCを検討した。X線照射した細胞から精製したDNAをDNase Iで消化し，SDS-PAGEで分離後，特異的抗体を用いたWestern blotによりタンパク質の有無を調べた。その結果，DNAに結合しヌクレオソーム構造を形成しているコアヒストン（H2A，H2B，H3，H4）およびリンカーヒストン（H1）がDPCに含まれることを明らかにした。
DPC修復機構：DPC特異的プロテアーゼとして，哺乳類ではWss1ホモログ（SPARTAN）が示唆されているが，SPARTAN欠損細胞のX線感受性や放射線誘発DPCの修復は調べられていない。修復野生型（WT）細胞およびSPARTAN-knockout（KO）細胞をX線照射し，生存率を調べた。KO細胞はWT細胞と同程度の生存率を示した。放射線誘発および他の化学的DPC誘発剤を含め，更なる修復機構の検討が必要であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
放射線が誘発するDPC生成に関してとして，ラジカルの非特異的な再結合（非特異的反応）により生成するType 1 DPCにコアヒストン とリンカーヒストンが含まれることを明らかにできた。また，DPC修復については，DPC特異的プロテアーゼとして，哺乳類ではWss1ホモログ（SPARTAN）が示唆されているが，放射線が誘発するDPC修復については，他のDPCプロテアーゼの関与およびプロテアーゼ非依存的な機構を示唆する結果が得られた。初年度に予定していた実験に概ね着手し成果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
放射線によるDPC生成機構については，Type 1 DPCに含まれるタンパク質の同定をさらに行う必要があることから，Western blotおよび質量分析等による同定を継続して行う。Type 2 DPCおよびType 3 DPCでは特定のDNA代謝酵素（Top 1・Top 2）がトラップされる。したがって，これらのDPC生成には特異的な機構があると予想される。Top 1およびTop 2は，酵素が作用するDNA近傍に損傷が存在すると，反応中間体がトラップされDPCを形成する。これを作業仮説として，Top 1およびTop 2（および新規に同定された酵素）の反応中間体をトラップする放射線誘発DNA損傷を明らかにする。
DPC修復機構については，Top 1・Top 2を含むDPCの修復に，TDP1，TDP2が関与する可能性がある。そこで，修復野生型（WT）細胞およびTDP1-knockout（KO）およびTDP2-KO細胞を，X線（Type 1～Type 3 DPC誘発），ホルムアルデヒド（Type 1），カンプトテシン（Type 2），エトポシド（Type 3）で処理し，誘発されたDPCの修復動態をWestern blotで調べる。また，照射線量・処理濃度を変え，WT細胞とKO細胞の生存率を比較する。SPARTAN- KO細胞についても同様に検討する。細胞のDPC修復動態と生存率の差違から，DPC修復に対するTDP1，TDP2関与の有無を明らかにする。
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Research Products
(5 results)
