2019 Fiscal Year Annual Research Report
Insect pest managing system based on directed evolution of a bacterial onsecticydal protein
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18H03397
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
佐藤 令一 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (30235428)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
天竺桂 弘子 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (80434190)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Cry1Aa毒素 / ABCC2 / Baculovirus/カイコガ蛹発現システム / T7ファージ / Cry8Ca |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①殺虫タンパク質（Cry1Aa毒素）上のABCC2結合領域の解析：Cry1Aa毒素のループ２および３の付け根部位に1アミノ酸置換あるいはシステインを2カ所に導入してS-S架橋してしまう変異体約40種類の作製を直接的に活性型殺虫タンパク質を生産するシステムを開発して実現した。変異導入活性型殺虫タンパク質の細胞膨潤活性をBmABCC2発現HEK293T細胞で、BmABCC2への結合親和性を表面プラズモン共鳴法で調べた結果、ループ２、３とループが作る窪みが重要であることが明らかになった。しかし、ループを構成する部位自体ではなく、ループの付け根にある幾つかのアミノ酸残基がBmABCC2への結合に重要であることが、1アミノ酸置換変異体の解析で明になった。
②活性の弱いものしかない現実を打破する方法および別の害虫に効くものに変換する方法の創生：3xFLAGタグをつけたコクヌストモドキのABCC4(TcABCC4)をBaculovirus/カイコガ蛹発現システムを大量に調製した。また、Cry8Ca殺虫タンパク質を提示したT7ファージを何も発現していないT7ファージ中から選抜するシステムを完成した。すなわち、このシステムを使ってTcABCC4に結合親和性がより高まったCry8Ca変異体を選抜できるようになった。
③ABCC2や3以外の受容体の解析:カイコガ幼虫中腸に発現するABCトランスポーター(BmABC)をHEK293T細胞に発現させ、Cry1Da、Cry1Ca、Cry9Aaの受容体として機能する分子を探索した。その結果、BmABCC1、4、7、8が幾つかの殺虫タンパク質に弱いながらも受容体活性を持つことが明になった。すなわち、殺虫タンパク質は感受性決定に関わる分子以外にも相互作用するABCトランスポーターを持ちうることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和元年度の計画のうち、①と④に関しては、計画以上に研究を大きく展開し、予想を上回る成果を得た。一方、②活性の弱いものしかない現実を打破する方法の創生と③別の害虫に効くものに変換する方法の創生に関しては、選抜方法までは完成した。しかし、これは当初の想定の範囲ではあるが、目指すレベルの変異体の選抜まではまだ到達しておらず、いよいよ本格的に選抜を繰り返し、「打破モデル」を完成しなくてはいけない。
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| Strategy for Future Research Activity |
①ABCトランスポーターC2(ABCC2)以外のCry1Aa毒素受容体の解析（１）：昨年度カドヘリン受容体を捕まえることに成功したCry1Aa毒素ビーズによる受容体プルダウンアッセイを改良して、本年度はBmABCC2を捕まえる条件を完成させる。その上で、Cry1CとCry1D毒素の真の受容体のプルダウンアッセイでの捕獲を試みる。
②ABCトランスポーターC2(ABCC2)以外のCry1Aa毒素受容体の解析（２）：多くのCry毒素の受容体がABCトランスポーター分子であることが分かってきた。そこで、カイコガの消化管細胞に発現している２０種類ほどのABCトランスポーター分子の中にCry1Ca、Cry1Da、Cry9Aaの受容体分子がないかを、それらトランスポータ―を発現させたHEK293細胞の膨潤アッセイで調べる。
③活性の弱いものしかない現実を打破するモデル作り：コクヌストモドキ(Tc)に極微な活性しか持たないCry8毒素に変異を導入し、TcABCC4分子に結合性を増し、結果的に活性が向上した変異体を選抜する「進化分子工学のトライアル」を、変異導入場所の異なる２種類のライブラリーで繰り返す。得られた変異体の活性向上の評価はTcABCC4発現培養細胞を用いたバイオアッセイで実施する。
④抵抗性打破モデル作り：チョウ目昆虫のCry1A毒素のへの抵抗性獲得は多くの場合ABCC2分子の欠損で起こる。しかし、Cry1A毒素に変異を導入し、ABCC3など類縁分子に結合性を獲得させることができるなら、Cry1A毒素変異体はそれら害虫の抵抗性を打破することができる。そこで、Cry1Aa毒素の幾つかの異なる場所に変異を導入し、カイコのABCC3に結合性を獲得させ、結果的にカイコに活性をもった変異体を選抜することを試みる。
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[Journal Article] ATP-Binding Cassette Subfamily A Member 2 Is a Functional Receptor for Bacillus thuringiensis Cry2A Toxins in Bombyx mori, but Not for Cry1A, Cry1C, Cry1D, Cry1F, or Cry9A Toxins2020
Author(s)
Xiaoyi Li, Kazuhisa Miyamoto, Yoko Takasu, Sanae Wada, Tetsuya Iizuka , Satomi Adegawa , Ryoichi Sato, Kenji Watanabe
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Journal Title
Toxins
Volume: 12
Pages: 104
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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