2018 Fiscal Year Annual Research Report
Blood flow-sensing mechanisms via lipid molecules in endothelial plasma membranes
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18H03510
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
山本 希美子 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (00323618)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安藤 譲二 獨協医科大学, 医学部, 特任教授 (20159528)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 血管内皮細胞 / Shear stress / 形質膜 / リン脂質 / コレステロール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血管内皮細胞(ECs)の働きは血流に起因するせん断応力によって調節を受けている。しかし、内皮細胞がどの様にせん断応力をセンシングするかは不明である。これまでメカノセンシングの研究は主として形質膜に発現する蛋白分子に焦点が当てられてきたが、本研究では、リン脂質２重膜である形質膜自体の力学応答という新しい視点からの解明を目指すことを目的として、力学刺激で起こる形質膜の物理的性質（脂質相や流動性）の変化や膜脂質分子（コレステロールやリン脂質）の動態を捉え、それらがイオンチャネル、受容体などの膜蛋白を介するシグナリング、引いては内皮細胞の機能変化に繋がるカスケードを明らかにすることが本課題の趣旨である。そこで本年度は、「力学刺激が惹起する細胞形質膜とモデル膜の物性変化」についての課題を中心に実験を行い、以下の結果を得た。
ECsに流れ負荷装置でshear stressを、伸展刺激装置や低浸透圧刺激によりstretchを加えたときに生じる細胞膜の物理的性質の変化を膜流動性、脂質相(lipid phase)転移、コレステロールを含む膜脂質成分の面から解析を進めた。具体的には、環境感受性のLaurdanを用いて細胞膜リン脂質のアシル鎖の運動性が低い(liquid-ordered：Lo)相と高い(liquid-disordered：Ld)相をイメージングし、光褪色後蛍光回復法により細胞膜の流動性を測定した。ECsにshear stressを作用すると、即座にLo相が減少し、膜流動性は増大した。Shear stressとstretchに応答するこの変化はカベオラが集積する部位で顕著であり、しかもその変化はshear stressの大きさに依存的であった。一方、ECsにstretchを負荷すると、Lo相が増大し、膜流動性は減少した。これらの変化は人工脂質二分子膜で構成される巨大リポソームでも同様に観察されたことから、物理現象であることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の目的を達成するために、期間全体として以下の3項目の研究を計画している。
1）力学刺激が惹起する細胞形質膜とモデル膜の物性変化
2）力学刺激下の膜コレステロールと膜リン脂質の動態解析
3）膜脂質分子を介したメカノトランスダクションと細胞応答
本年度は1）力学刺激が惹起する細胞形質膜とモデル膜の物性変化の項目を明らかにすることができたことに加え、2）と3）の項目についての予備的な検討を終了することができた為。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、研究目的と計画に沿って、以下の項目の検討を推進する。
2）力学刺激下の膜コレステロールと膜リン脂質の動態解析
3）膜脂質分子を介したメカノトランスダクションと細胞応答
特に、2019年度には、力学刺激で起こる膜脂質分子の分布や種類、量の変化を解析する。具体的には、コレステロールに高い親和性を示す蛍光プローブ(D4-EGFP、Dehydroergosterol)を用いたライブイメージングで、せん断応力と伸展張力を作用させた形質膜の膜コレステロールの分布の変化を、量的変化はフローサイトメトリと生化学的手法で測定する。併せて、コレステロール集積蛋白であるストマチンの細胞内挙動を解析する。膜リン脂質の動態については特異的な蛍光プローブを用いたライブイメージングと高感度な定性・定量分析が可能な高速液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）による解析を行う。以上の検討により、膜脂質分子の動態が形質膜の物性変化や膜蛋白を介したメカノトランスダクションに果たす役割を明らかにする。
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