2018 Fiscal Year Annual Research Report
New development in fluorescent immunosensor based on the quench-release principle by protein and peptide engineering
| Project/Area Number |
18H03851
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
上田 宏 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (60232758)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大室 有紀 (松山有紀) 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (30571088)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | バイオセンサー / バイオテクノロジー / 抗体 / 抗原 / 蛍光 / クエンチ / ペプチド / ケミカルバイオロジー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
１）コイルドコイルペプチドを用いたQ-body構築法の開発 従来，蛍光免疫センサーQ-bodyはそのN末に短いペプチドを介して色素を修飾することにより構築されてきたが，特異的定量的な色素修飾にまつわる問題が避けられなかった。今回，安定性の高いコイルドコイル構造を形成するE4-K4ペアを用いて，抗体H鎖(FabあるいはVHH鎖)N末にE4配列を付加し，末端をTAMRA修飾したK4ペプチドを混合することで，簡便かつ高い応答で抗原を蛍光検出できるQ-bodyを構築できることが判明した。
２）発光エネルギー移動(BRET)に基づくQ-bodyの構築 通常のQ-bodyよりも高い応答を示すBRET Q-bodyについて，抗原依存的なBRET効率向上がその主な原因であることを特定した。さらにその機構の解明を行い，抗原添加による色素の抗体外への移動に伴う，色素と酵素間の距離の減少が主な理由であることが判明した。
３）コイルドコイルペプチドを用いたFRET Q-body構築 従来，二種の異なる色素を二つのN末端に導入したUltra Q-bodyは高い応答を示すが構築が難しい問題があった。今回，上記のK4ペプチドの適当な位置にフルオレセインを導入することで，抗原依存的に二色の蛍光比，さらにはFRET効率が変化するFRET型Q-bodyを簡便に構築できることが判明した。これにより488 nmレーザーを用いたセルソータを選択に使えるようになり，今後のファージ・細胞提示系を用いた高性能Q-bodyスクリーニングへの道が開けた。
４）酵母提示系の立ち上げ 今後の酵母提示系による抗体選択のため，モデル系として単量体ストレプトアビジンの酵母細胞壁への機能的提示を試み，これに成功した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画のうち，
(1) 単ドメイン抗体の利用 に関して，ライブラリ構築までには至らなかったが，低分子抗がん剤に対して高感度で高い蛍光応答を示すVHH型Q-bodyの構築に成功した。これ自身が大きな成果であるとともに，これを陽性コントロールとして，以下のライブラリ選択作業を効率的に進めることが可能になった。
(2) 細胞表面提示抗体ライブラリを用いた高効率Q-body選択 に関して，予定通り酵母菌体上で蛍光測定を行う系を構築できた。すなわち蛍光応答の高い抗体クローンにコイルドコイル形成タグを付加し，ペプチドを介した蛍光標識により，直接標識に匹敵する高い抗原応答が得られる系を構築できた。さらに，ペプチドを２色の蛍光色素で標識することで，セルソーターで高い応答で多色解析と選択が可能になるという計画以上の成果を得た。
(3) 発光酵素，他の色素との融合 について，抗原依存的な色素の移動に伴うBRET効率の上昇による，Q-body応答向上に成功した。さらに，発光色素の一部配列を融合した抗体が，抗原依存的な発光活性上昇を示す新規な知見を得た。また，２色標識コイルドコイル形成ペプチドを用いたQ-bodyについても，BRET系と同様に抗原依存的な色素の移動に伴うFRET効率の上昇が起きる事を発見した。これらについて，現在特許出願と学会発表を準備している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
基本的に当初計画の通りに研究を進めるが，質の高いQ-bodyを効率的に得られる可能性が高まったため，血中や環境中の低分子ホルモンなど，より多様かつ実用的なターゲットを対象に選び選択を進める。
|
