2020 Fiscal Year Annual Research Report
New development in fluorescent immunosensor based on the quench-release principle by protein and peptide engineering
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18H03851
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
上田 宏 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (60232758)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | バイオセンサー / 抗原抗体反応 / 免疫測定法 / 蛍光クエンチ / 抗体工学 / ペプチド工学 / タンパク質工学 / ケミカルバイオロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 酵母提示抗体ライブラリを用いた高性能なQ-body選択
研究協力者である琉球大学村上博士より分与を受けた30種余りの血清アルブミン結合VHHを材料に，これらをコイルドコイル形成ペプチドE4と融合して酵母細胞表面で提示させ，外部からFITC-TAMRA標識コイルドコイル形成ペプチドK4を付加してQ-body化し，抗原応答の高いQ-bodyを選択した。この結果得られた，抗原依存的蛍光応答の高いクローンは，大腸菌で発現させてQ-body化しても他のクローンより高い応答を示した。その他，陽性対照として用いた抗がん剤MTX検出用mini Q-bodyについての論文発表を行った(ACS Sensors)。
2. コイルドコイル形成ペプチドを付加した抗体結合タンパク質の利用
抗体Ｌ鎖結合タンパク質Protein M (PM)は，抗体結合時にそのC末端が抗原結合部位近傍に位置する。ここに蛍光色素を導入することで，抗体と混合するだけでQ-body様の蛍光応答を得る事が出来る（PM Q-probe; 董ら, Biosens. Bioelectron.）。より色素修飾部位近傍の構造多様性を高めるため，PMを直接色素標識する代わりにコイルドコイル形成配列E4を付加した。そしてＮ末を蛍光色素TAMRAで標識したコイルドコイル形成ペプチドK4を添加し，未修飾のFab断片を簡便にQ-body化できるか検討した。この結果，モデル抗体である抗BGP抗体Fab断片とPMプローブ-ペプチド複合体を混ぜて2時間おくことで，予想以上の蛍光クエンチが確認され，更に抗原BGPペプチドの添加により蛍光が約４倍増大する現象が見出された。この応答は直接色素標識PM Q-probeのそれを大きく上回るものであった。また二色標識K4ペプチドを用いて蛍光強度比から精度良く測定を行う事にも成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
コロナ禍のため実験進行と学会発表については特に前半かなりの影響があったが，論文発表については比較的順調に進めることが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．については酵母表層上あるいはアガロースビーズ上での応答の方が若干高かったため，固相表面でのQ-body間距離がクエンチに影響している可能性を検討している。今後，抗原結合部位にトリプトファンをランダムに導入したライブラリから更に応答の良いクローンの選択を試みたい。
２．コイルドコイル形成ペプチド付加Coiled Q-probeについては，今後，他の低分子認識抗体について応答を評価検討するとともに，細胞表層での抗体選択法開発への応用を試みたい。
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