2018 Fiscal Year Annual Research Report
Single cell mapping of epigenetic modifications through super-nucleosome construction
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18H03931
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
岡本 晃充 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (60314233)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヒストン / 化学合成 / ペプチド / DNA / ヌクレオソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、種々の生命現象におけるヌクレオソーム機能の制御と意義を理解するために、研究代表者独自の方法で任意の位置に特定の修飾を入れた化学構造的にピュアな人工ヌクレオソームを製造し、これらの生細胞内のヌクレオソームダイナミクスを超解像顕微鏡観察を用いて時空間的に捉えて、ヌクレオソーム修飾の意味を明らかにする。また、独自の化学合成を通して、天然にはない標識や反応性官能基、複数の複雑な機能性ユニットをヒストン構造に入れられるので、機能解明を支援する創造的スーパーヌクレオソームを作成して未知のヌクレオソーム機能を明らかにする。
本年度では、コアヒストン4種類（H2A, H2B, H3, H4）およびリンカーヒストンH1の合成法を確立した。H2AおよびH2Bの合成が終了したとともに、既知のH3とH4の合成についても我々独自の合成法を確立した。H1についてもほぼ終了した。合成したヒストンは、601DNAとともにヌクレオソームを再構成させた。また、標識ヒストンバリアントH2A.Xを同様の方法に従って化学合成することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
人工ヌクレオソームの化学的製造法の確立が終了し、エピジェネティック修飾ヌクレオソームの合成・再構成と熱力学解析へ研究が向かっている。また、機能化ヒストンバリアントの作成が一部終了し、次の生化学的な検討段階へ入っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
原子による細胞機能制御の本質を見抜くために、天然にはない機能を付与した「スーパーヌクレオソーム」を化学合成して、ヌクレオソームのエピジェネティック修飾機能をつぶさに解明する。
（１）DNA配列特異性を持つユニット（亜鉛フィンガーやペプチド核酸など）を連結したヒストンタンパク質を作成し、配列特異的ヌクレオソーム形成を誘導して、人工的な遺伝子発現制御を試みる。
（２）特定の箇所の特定の修飾に対してライター（修飾）・リーダー（認識）・イレーサー（脱修飾）タンパク質を捕捉するために、光親和性修飾や結合特異性蛍光修飾を近在させたスーパーヌクレオソームを作成する。捕捉したタンパク質は酵素分解及び質量分析を経て同定される。
既に確立した方法で非天然の特殊機能を付与したスーパーヌクレオソームを合成する。ペプチド合成工程を拡大して亜鉛フィンガーやペプチド核酸をヒストンに付加することにより、DNA配列選択的にクロマチン構造を固定できるヌクレオソームを作成する。また、ジアジリンやベンゾフェノン等の光親和性標識やチアゾールオレンジやプロダン等の結合特異的蛍光標識を含むヌクレオチドもしくはアミノ酸を開発して、これらを含むスーパーヌクレオソームを合成する。これらの標識を活用したヌクレオソーム構造解析と細胞内動態解析を進めるとともに、光親和性標識によって修飾特異的なライター・リーダー・イレーサータンパク質を捕捉する。プルダウンした後に、酵素分解して質量分析することによりタンパク質を同定する。
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Research Products
(6 results)
