2019 Fiscal Year Annual Research Report
Single cell mapping of epigenetic modifications through super-nucleosome construction
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18H03931
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
岡本 晃充 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (60314233)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヌクレオソーム / ヒストン / ペプチド / DNA / 化学合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
種々の生命現象におけるヌクレオソーム機能の制御と意義を理解するために、研究代表者独自の方法で任意の位置に特定の修飾を入れた化学構造的にピュアな人工ヌクレオソームを製造し、これらの生細胞内のヌクレオソームダイナミクスを超解像顕微鏡観察を用いて時空間的に捉えて、ヌクレオソーム修飾の意味を明らかにすることを目指した。
今年度は、コアヒストン4種類（H2A, H2B, H3, H4）およびリンカーヒストンH1の合成法を確立した。方法としては、標的のヒストンユニットを2～3のフラグメント（ヒストン配列中のアラニン残基のN末端側で切断した20～60アミノ酸超のペプチドフラグメント）に分けて化学合成し、あとでこれらを連結する方法を用いた。フラグメントのC末端側は、ヒドラジドの酸化を経由するチオエステル形成法を用いた。N末端のアラニンは、システインで置き換えた。各ペプチドフラグメントを合成した後、化学連結反応を行い、システインの脱硫反応を経由して全長ヒストンを得た。得られたヒストンタンパク質と別途に合成した200塩基長の（メチル化）DNAとを混合することにより、ヌクレオソームを再構成し、それをゲル電気泳動で確認した。ヌクレオソームのフォールディングレベル及び構造簡易解析はSYPRO orangeを用いた熱力学安定性試験を行うことによって評価した。また、クライオEMも使用して、DNAがヒストンに巻きついたヌクレオソーム構造を確認した。
既に終えているコアヒストンに加え、H1の合成も終了した。ヒストンバリアントH2AXやH2AZも合成した。また、ユビキチン合成およびユビキチンが付加したH2Aの合成も達成した。合成したヒストンは、DNAとともにヌクレオソームを再構成させた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H1の合成も終了した。ヒストンバリアントH2AXやH2AZも合成した。また、ユビキチン合成およびユビキチンが付加したH2Aの合成も達成した。合成したヒストンは、DNAとともにヌクレオソームを再構成させた。スーパーヌクレオソームの実現が目の前にある。
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| Strategy for Future Research Activity |
従来法のように組織をすりつぶしては組織内の不均一性の情報が失われるが、研究代表者が独自に開発した配列特異的DNAメチル化捕捉人工核酸「ICONプローブ」を用いた「MeFISH法」による散在反復配列LINE-1やAluのメチル化イメージングと蛍光標識ヒストンH2AやCENP-Aによるクロマチンイメージングを併用して、セントロメア周辺における腫瘍DNAメチル化とクロマチン構造の相関を可視化し、動的ヌクレオソーム構造と機能の解析に立脚した腫瘍内の不均一性の解析を行い、１細胞内エピジェネティクスマップを創り上げる。
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