2020 Fiscal Year Annual Research Report
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18H03935
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
菊地 和也 大阪大学, 工学研究科, 教授 (70292951)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 化学プローブ / 蛋白質ラベル化 / GLUT4 / PYPタグ / β-ラクタマーゼタグ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではPYPタグを用い、グルコース取り込みに関与する膜蛋白質GLUT4の機能解析を目的としている。今年度は細胞膜上に移行したGLUT4の膜局在維持機構を解明するため、GLUT4にラベル化した近傍の分子を捉える新たなプローブの開発に取り組んだ。プローブとして、細胞膜非透過性のPYPタグリガンドとビオチンを有する分子を設計した。ビオチンの導入により、ストレプトアビジンを用いた蛋白質の回収や解析が容易になると考えた。設計したプローブを合成し、PYPをGLUT4の細胞膜側に面するループ上に提示させた融合蛋白質（PYP-GLUT4）を発現させた細胞に対しラベル化を行った。ストレプトアビジンで標識しSDS-PAGEならびにイメージングにより、PYPのラベル化が行われていることを確認した。続いて市販のクロスリンク剤により、蛋白質同士を架橋させた後に、蛋白質を可溶化し、ビオチン-ストレプトアビジンの相互作用を利用してPYP-GLUT4 が結合した蛋白質を特異的に回収、濃縮した。SDS-PAGEによる解析より、PYP-GLUT4が発現した細胞特異的に新たな蛋白質由来のバンドが確認できた。
また、BLタグを用いた膜蛋白質動態の解析においては、新たに開発したプローブを細胞膜内葉に発現する蛋白質のラベル化に適用するために、細胞膜透過性のラベル化プローブの開発に着手した。リガンドとして用いているβラクタマーゼ阻害剤にはスルホン酸が導入されているため、そのままでは細胞膜透過性を有していない。そこで、スルホン酸部位を近年報告されたプロドラッグに用いられるカルボン酸エステルに置き換えたプローブを設計、合成した。カルボン酸エステルを有するプローブは細胞内透過性を持ち、中性緩衝液中で自発的に分解が起こり、カルボン酸へと変換されることが確認された。このプローブにより細胞内蛋白質のラベル化に成功した。
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| Research Progress Status |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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