2018 Fiscal Year Annual Research Report
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18H03937
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
大利 徹 北海道大学, 工学研究院, 教授 (70264679)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森田 洋行 富山大学, 和漢医薬学総合研究所, 教授 (20416663)
濱野 吉十 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (50372834)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ペプチドエピメラーゼ / ペプチドグリカン / ラッソペプチド / γ-ポリグルタミン酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①微生物のペプチドグリカンの生合成に関与する新規エピメラーゼ（MurL）；
UDP-MurNAc-L-Ala-L-Gluの末端のL-Gluのエピメリ化を触媒するMurLは既知酵素との相同性を有さず、特異的モチーフもない。そこで反応機構の手掛かりを得るため、組換え酵素と基質やアナログとの共結晶化とX線結晶構造解析を行った（研究分担者；森田）。これまでに、アポ体（分解能1.９ Å）とAMP-PNPとUDP-MurNAc-L-Ala-L-Gluの複合体（分解能1.７ Å）との結晶構造を得た。
②リボソームにより合成されるラッソペプチド（MS-271）；異種宿主発現により、MS-271の生合成遺伝子クラスター内にMS-271のC末端のTrpのエピメリ化に関与する遺伝子が存在することを明らかにした。しかし、既知の異性化酵素と相同性を示す遺伝子はクラスター内に存在しなかった。そこでin vivoで探索するため、プレカーサーペプチドの大腸菌での発現を試みた結果、N末に4アミノ酸を付加することにより発現できた。
③ポリグルタミン酸（PG）；重水素標識されたD-GluとL-Gluを化学合成した。これらを、PG生合成酵素遺伝子（pgsBCA遺伝子）を持つD-Glu 要求性大腸菌WM335株（Gluラセマーゼ欠損株）に投与し、PGにラベルが取り込まれるか検討した。生産されたPGをモノマーに分解後、キラルカラムで分離し、質量分析を行った。その結果、重水素標識されたD-Glu を投与した際、PGに重水素D-Glu は全く取り込まれず、他方、重水素標識されたL-Glu を投与した場合は、PGに重水素L-GluとD-Gluの両方が取り込まれた。以上の結果より、PGのD-GluはL-Gluが取り込まれた後、エピメリ化により生成することが証明された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
ペプチドグリカンとMS-271の生合成に関与する各々新規のエピメラーゼに関しては、最も困難と思われた結晶化とプレカーサーペプチドの大腸菌での発現が各々達成できたことから順調に進展している。γ-ポリグルタミン酸に関しても、予想通りの結果が得られており、順調に推移していると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
微生物のペプチドグリカンの生合成に関与する新規エピメラーゼに関しては、さらなる共結晶化と反応機構の推定、変異酵素を用いた実証を継続する。
ラッソペプチド（MS-271）に関しては、大腸菌を宿主に用い、in vivoでプレカーサーペプチドとクラスター内の他の酵素を共発現させ、異性化が進行するか検討する。進行すればin vitroでも実証する。
γ-ポリグルタミン酸に関しては、D-Glu含有量が異なるPGの生産菌からpgsA遺伝子を取得し、従来のpgsAと置換し、PGのD-Glu比率が変化するか検討する。
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