2019 Fiscal Year Annual Research Report
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18H03937
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
大利 徹 北海道大学, 工学研究院, 教授 (70264679)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森田 洋行 富山大学, 和漢医薬学総合研究所, 教授 (20416663)
濱野 吉十 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (50372834)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ペプチドエピメラーゼ / ペプチドグリカン / ラッソペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
以下の2つのペプチド新規異性化酵素について詳細な解析を行った。
①微生物のペプチドグリカンの生合成に関与する新規エピメラーゼ（XOO_1319）；
UDP-MurNAc-L-Ala-L-Gluの末端のL-Gluのエピメリ化を触媒する酵素（MurL）は、ATPを要求する新規エピメラーゼである。反応液中にAMPが検出されることから基質はアデニル化により活性化されると予想される。そこでヒドロキシルアミンによる中間体のトラップ実験を行った結果、ヒドロキサム酸誘導体が検出されたことから、アデニル化による活性化が確認できた。また昨年度、MurLのアポ体のX線結晶構造解析を行ったが、基質結合部位と推定される領域がオープン構造とっており、反応機構を推定するまでには至らなかった。そこで、放線菌Micromonospora属由来とSalinospora属由来のMurLについてもアポ体の結晶構造解析を行った。その結果、同様の構造が得られ、オープン構造が本酵素群の共通の構造であると判断された。そこで反応機構解明に必須である、基質類縁体との共結晶を得るためにアデニル化反応中間体ミミックの合成を行った。現在、化学合成と酵素合成を組み合わせ、少量スケールでの目的化合物の合成に成功している。
②リボソームにより合成されるラッソペプチド（MS-271）；昨年度、MS-271のC末端のL-Trpのエピメリ化に関与する遺伝子を同定した。今年度、大腸菌異種宿主発現系を用い詳細に解析した結果、プレカーサーペプチド、エピメリ化酵素、プロテアーゼ遺伝子を発現させた結果、C末端のTrp の異性化反応が進行した。現在、in vitro実験での再現を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ペプチドグリカン生合成に関与する新規のエピメラーゼに関しては、反応機構解明のための鍵となる、アデニル化反応中間体ミミックとの共結晶を得るためのミミック体の合成に目処がついた。また、MS-271の生合成に関与するエピメラーゼに関しては、3つの遺伝子によるin vivo異性化反応の検出に成功したことから順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
微生物のペプチドグリカンの生合成に関与する新規エピメラーゼに関しては、反応中間体ミミックとの共結晶化と反応機構の推定、変異酵素を用いた実証を行う。ラッソペプチド（MS-271）に関しては、in vivoで得た結果のin vitroでの再現を試みる。
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