2018 Fiscal Year Annual Research Report
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18H03940
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
柳澤 修一 東京大学, 生物生産工学研究センター, 教授 (20222359)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 植物 / 硝酸シグナル / NLP転写因子 / 栄養シグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
硝酸応答型NLP転写因子が直接制御する遺伝子候補であるアスパラギン酸オキシダーゼ（AO）遺伝子がNLP転写因子によって制御されていることを確認するため、転写抑制型へと変換したNLP転写因子を発現している形質転換シロイヌナズナを用いてqRT-PCR解析を行った。その結果、NLP転写因子によるAO遺伝子の発現制御が確認されたことから、次にAOプロモーター中のNLP結合部位を電気泳動移動度シフトアッセイによって同定した。このNLP結合部位に点変異を持つ変異型AOプロモーターを作製して、変異型プロモーターはNLP転写因子によって活性化されないこと、また、硝酸誘導性も失っていることを明らかにした。そこで、次に、野生型AOプロモーターの制御下で発現するAO遺伝子と変異型プロモーターの制御下で発現するAO遺伝子を用いてAO機能欠損株の相補実験を実施した。AOはde novoのNADH合成経路の鍵酵素であり、そのため変異型AO遺伝子をホモに持つ個体は致死となる。そこで、変異型AO遺伝子をヘテロに持つシロイヌナズナに遺伝子を導入した。その結果、野生型AOプロモーターを使用した場合でも、変異型AOプロモーターを使用した場合でも、内在性のAO遺伝子が変異型となっている形質転換シロイヌナズナを作出することができた。しかしながら、変異型AOプロモーターを用いた場合は生育不良を示した。変異型AOプロモーターを用いたことの影響は、新鮮重あたりのNADHやNADPH含量に対しては比較的小さいと評価されたが、個体あたりのNAD合成量は半減していたことにより、硝酸シグナル伝達によりAO遺伝子の発現が誘導されて成長量に見合ったde novo NAD合成が維持されることはシロイヌナズナの成長に重要であることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
植物は主たる窒素源である硝酸イオンを感知し、遺伝子発現や代謝バランスを大きく変化させ、窒素栄養環境に合わせた成長の最適化を行う。この最適化のための応答は硝酸シグナル応答と呼ばれるが、硝酸シグナル応答を引き起こす最初の転写因子がNLP転写因子であることから、NLP転写因子の標的遺伝子の同定やこの転写因子の活性調節の解析などによって植物における硝酸シグナル伝達に関する総合理解を達成することが本課題の目的である。この目的に沿って、NLP転写因子の新規標的遺伝子としてAO遺伝子を同定し、これによって、これまで全く明らかにされてこなかった、代謝調節に硝酸シグナル伝達が大きな影響を及ぼすことの理由を解明しつつある。このことから、進捗状況は、ほぼ順調であると評価される。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度の解析によって、NLP転写因子を介して硝酸シグナル伝達によって成長量に見合ったNAD合成が維持されていることが示唆された。そこで、本年度は、まず、野生型AOプロモーターの制御下で発現するAO遺伝子と変異型プロモーターの制御下で発現するAO遺伝子を用いて作製したシロイヌナズナ形質転換体のメタボローム解析を行い、硝酸シグナルによってde novoのNAD合成が促進される意義を精査する。一方で、NLP転写因子によって発現が促進される転写抑制因子の標的遺伝子に、リン飢餓応答を引き起こす転写活性化因子の抑制因子が含まれることがわかってきた。そこで、NLP転写因子を起点とした転写カスケードによって硝酸シグナル伝達がリン飢餓応答に影響を及ぼしている可能性を検討する。また、硝酸シグナル応答の多様性に迫るために、シロイヌナズナに9つ存在するNLP遺伝子の個々の変異体の解析を進めた結果、NLP7に加えて、NLP2も成長制御に大きな役割を持つことがわかってきた。そこで、nlp2変異体を用いたトランスクリプトーム解析を行い、NLP2とNLP7の標的遺伝子の重複と相違を明らかにし、NLP転写因子を介した硝酸シグナル伝達の全容に迫る。また、平成30年度には、NLP転写因子のタンパク質化学的解析に向けてシロイヌナズナのNLP6とNLP7を大腸菌で発現させる試みも実施していた。組換えNLPタンパク質を部分精製しゲルろ過クロマトグラフィーによって挙動を調べたところ、このタンパク質は大腸菌由来のタンパク質と結合している可能性が示唆されたことから、今年度は小麦胚芽タンパク質合成系による無細胞タンパク質合成によって組換えNLPタンパク質の調製を試みる。この試みによっても適切な試料が得られない場合は、植物個体あるいはプロトプラストを用いた実験系の構築を試みる。
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[Journal Article] A phytochrome B-mediated regulatory mechanism of phosphorus acquisition2018
Author(s)
Sakuraba, Y., Kanno, S., Mabuchi, A., Monda, K., Iba, K., and Yanagisawa, S.
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Journal Title
Nature Plants
Volume: 4
Pages: 1089-1101
DOI
Peer Reviewed
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