2018 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation and application of molecular mechanism of Phytophthora sexual reproduction controlled by mating hormones
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18H03943
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
小鹿 一 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (50152492)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹本 大吾 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30456587)
矢島 新 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (30328546)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 疫病菌 / 交配ホルモン / 有性生殖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
農作物に甚大な被害を与える病原糸状菌「疫病菌」は変異が早く、薬剤耐性化が問題となっている。その主要因とされる有性生殖の分子機構の解明は、疫病菌の制御に向けた重要課題である。疫病菌の有性生殖は超微量で働く二種の交配ホルモンにより制御されている。本課題では、交配ホルモン生合成酵素・受容体の特定、さらに細胞内シグナル伝達系の解明により、疫病菌有性生殖の分子基盤を確立し、そに立脚した疫病菌制御の方法を探ることを目的とする。
交配ホルモンはphytolの酸化で生成すると考えられることから、酸化酵素シトクロームP450（CYP）が生合成酵素と予想し、６種のCYP阻害剤を投与することでホルモン生産性の変化を調べた。その結果、fluconazoleがA1, A2両交配型でホルモン生産を阻害したことから、ホルモン生合成酵素はCYPの可能性が高いことが分かった。一方、遺伝子発現解析による生合成酵素遺伝子の同定を目指した。2菌種（P. nicotianaeおよびP. capsici）それぞれについてA1, A2両交配型からRNAを抽出しRNA-Seq解析を行った。A1-A2間の発現差解析からホルモン生産性と相関して発現するCYP遺伝子を探索した結果、有望な候補が１つ見つかった。この遺伝子について菌類での異種発現とphytolのホルモンへの変換反応を進めている。
以上の生合成酵素の研究と同時に、ホルモン受容体の探索を進めた。これまでの研究で受容体タンパク質の発現量は極めて低いと予想されるので、生化学的手法は断念し、上記のRNA-Seq解析結果を活用して遺伝子発現解析を進めた。絞込みでは、交配ホルモンの高い脂溶性から受容体が核内受容体スーパーファミリーに属すると仮定し、保存された塩基配列に着目した結果、数個の候補遺伝子が見いだされた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交配ホルモンはphytolから生合成され、単純な酸化で生成したと考えられることから、酸化酵素シトクロームP450（CYP）が生合成酵素と予想し、これを検証することを目指した。まず、数種類のCYP阻害剤によりホルモン生産が抑制されるかを調べた結果、fluconazoleが阻害作用を示したことから、ホルモン生合成酵素がCYPである可能性が高いことが分かり、生合成酵素同定に大きく前進した。一方、前年度に引き続き、酵素を直接抽出精製する試みを計画していたが、極端に不安定なことが判明し、以下に述べる遺伝子解析的手法にシフトした。
A1, A2交配型はそれぞれα2, α1ホルモンを特異的に生産するので、遺伝子発現解析によりホルモン生合成遺伝子を同定しようと計画した。2菌種（P. nicotianaeおよびP. capsici）それぞれについてA1, A2両交配型を選別・培養し、RNAを抽出、RNA-Seq解析を行った。A1-A2間の発現差から数十の遺伝子候補が見いだされ、CYP遺伝子で絞り込みを行うことで有望な候補を１つ見出すことに成功し、当初の目的がほぼ達成された。この遺伝子について菌類での異種発現とphytolのホルモンへの変換反応を進めている。
以上の生合成酵素・遺伝子の研究と同時に、ホルモン受容体の同定を目指した。上記のRNA-Seq解析結果を活用して遺伝子発現解析を進め、多数の候補が見いだされたが絞り込みが容易ではないことが判明した。交配ホルモンの高い脂溶性から受容体が核内受容体スーパーファミリーに属すると仮定し、保存された塩基配列に着目した結果、数個の候補遺伝子が見いだされた。しかし、仮定が間違っていた場合を想定し、遺伝学的アプローチ、変異導入アプローチへ展開する準備を進めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
疫病菌交配ホルモン生合成酵素遺伝子については、阻害剤を使った実験からシトクロームP450（CYP）である可能性が高くなった。このため、その後に行った遺伝子発現解析での絞り込みが極めて順調に進み、α2生合成の候補遺伝子の1つを見出すことに成功した。今後は、研究分担者らが確立した植物共生真菌を宿主にした異種発現系を利用して、この遺伝子がphytolをα2に変換するのかどうかを検証してゆく。また、α1生合成遺伝子の候補はまだ明確には見出していないので、RNA-Seqによる遺伝子発現解析を再度進める予定である。
交配ホルモン受容体遺伝子についても、遺伝子発現解析により進める予定であるが、A1, A2交配型間の発現比だけでは候補遺伝子は数百にのぼる。したがって絞り込みの指標をどう設定するかが大きな課題である。今後は以下のように実験を進める予定である。(1)ホルモンの高い脂溶性から受容体が核内受容体であると仮定し、DNA結合領域など保存された塩基配列に基づきゲノムマイニングを行う。(2)遺伝学的理論に基づきA1, A2両交配型の掛け合わせから得られる子孫の遺伝子解析を行い、ホルモン感受性に関わる遺伝子の炙り出しを行う。(3)変異原物質処理によりランダム変異を導入し、ホルモン感受性に関わる遺伝子の炙り出しを行う。将来的には、以上の結果を総合的に考慮して受容体候補遺伝子を特定し、遺伝子ノックダウン実験で受容体を証明する。
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[Journal Article] Resistance to Phytophthora infestans: exploring genes required for disease resistance in Solanaceae plants2018
Author(s)
Takemoto, Daigo; Shibata, Yusuke; Ojika, Makoto; Mizuno, Yuri; Imano, Sayaka; Ohtsu, Mina; Sato, Ikuo; Chiba, Sotaro; Kawakita, Kazuhito; Rin, Soriya; Maurizio Camagna
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Journal Title
J. Gen. Plant Pathol.
Volume: 84
Pages: 312-320
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Presentation] Two types of lipid elicitors with different functions from the potato pathogen Phytophthora infestans2018
Author(s)
Makoto Ojika, Ryo Murata, Shiho Tenhiro, Mohammad S. Monjil, Takeshi Nozawa, Yasuhiro Ito, Shinya Wada, Yusuke Shibata, Daigo Takemoto, Kazuhito Kawakita
Organizer
30th International Symposium on the Chemistry of Natural Products and the 10th International Congress on Biodiversity (ISCNP30 & ICOB10) (Athens, Greece)
Int'l Joint Research
