2021 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation and application of molecular mechanism of Phytophthora sexual reproduction controlled by mating hormones
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18H03943
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
小鹿 一 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (50152492)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢島 新 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (30328546)
竹本 大吾 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30456587)
柴田 貴広 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (80447838)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 疫病菌 / 交配ホルモン / 有性生殖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2020年度までに交配ホルモンα2の生合成酵素（シトクロムP450）遺伝子の１つを同定し、交配ホルモン受容体についてはトランスクリプトーム解析が完了した。これを受けて2021年度は以下の成果を上げることができた。
（１）生合成酵素遺伝子の同定：α2生合成酵素として予想している第二の酵素（シトクロムP450と予想）を同定するため、RNA-seq解析で得られた３つの候補遺伝子を植物内生真菌Epichloe sp.を宿主に異種発現を試みた。また、α1生合成酵素遺伝子についても、候補遺伝子をリストアップできたので、第１候補の異種発現を試みた。しかしいづれもホルモンの生産を確認できなかった。そこで、これら酵素遺伝子がホルモン前駆体（phytol、α2）の存在により発現上昇すると仮定し、前駆体共存下で培養した疫病菌体からRNAを取得しRNA-seq解析を行った。その結果、α1生合成酵素の新たな候補が見いだされたので2022年度に異種発現を行う。
（２）ホルモン受容体の探索：A1交配型（α2受容体を発現）とA2交配型（α1受容体を発現）間の遺伝子発現比、核内受容体スーパーファミリーに共通の特徴、および構造類似性をもとにin silico解析を行い、６組のα1/α2受容体ペアの候補を絞り込むことに成功した。また、これと並行して遺伝学的アプローチによる受容体探索を進めた。すなわち、A1-A2の交配で得られたF1世代の自家受精、または自家受精可能なホモタリック種のF1世代からA1, A2交配型株を複数作出し、次世代シーケンス解析により交配型特異的発現遺伝子を特定するものである。その結果、ホモタリック種のF1株を約40取得した。現在交配型の決定を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
交配ホルモンα2の第２の生合成遺伝子およびα1生合成遺伝子の同定が難航している。この原因としてα2を生産するA2交配型とα1を生産するA1交配型の間での候補遺伝子発現レベルの差が少ないことが考えられたので、ホルモン生合成前駆体が発現に影響すると予想して実験計画を進めている。一方、ホルモン受容体については、in silico解析による絞込みは完了したが、確認するための遺伝子ノックダウンの実験系の設定が進んでいない。
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| Strategy for Future Research Activity |
交配ホルモン生合成遺伝子については、第２のα2生合成遺伝子とα1生合成遺伝子の同定で苦戦を強いられているが、ホルモン生合成前駆体が標的遺伝子の発現を亢進するという仮説に基づき新たな実験を開始している。すでにα2添加培地で培養したA1交配型のRNA-seqが完了したのでα1生合成遺伝子探索を進める。α2生合成遺伝子については過去のデータ解析で候補としなかった遺伝子について、前駆体（phytol）添加培地で培養したA2交配型のRNAを使ってリアルタイムPCRにより発現上昇を確認する。新たに見出した候補遺伝子については異種発現により生合成酵素であることを証明する。 ホルモン受容体の探索については、in silico解析で絞り込んだ候補遺伝子のノックダウン実験を計画・遂行する。同時に遺伝学的アプローチとして、引き続き両交配型の交配で生じたF1世代の自家受精株またはホモタリック種の自家受精F1世代からA1, A2交配型株を選別し次世代シーケンス解析に供し、保存配列から受容体遺伝子候補を炙り出す実験を継続する。
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