2019 Fiscal Year Annual Research Report
Application of natural antibodies from cartilaginous fish
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18H03958
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| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
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Principal Investigator |
近藤 秀裕 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (20314635)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
廣野 育生 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (00270926)
羽生 義郎 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (20357792)
筒井 繁行 北里大学, 海洋生命科学部, 准教授 (20406911)
矢澤 良輔 東京海洋大学, 学術研究院, 准教授 (70625863)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 魚介類免疫 / バイオテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は千葉県、神奈川県、および福岡県の沿岸で採取されたドチザメの血清を用い、血清タンパク質濃度および種々の抗原に対する抗体の結合能を解析した。血清タンパク質濃度および病原微生物Aeromonas hydrophilaに対する結合能は、それぞれの地域で大きく異なることが示された。このような違いが個体の生理状態とどのように関わるかについては不明なままである。また、ドチザメ血清より種々のカラム操作により高純度のIgM画分を得た。このIgMをビオチン標識した後、2種類のグラム陽性菌、3種類のグラム陰性菌、および酵母と混合したところ、すべての区においてドチザメIgMが検出された。さらに、ドチザメ血清を用い病原微生物の凝集試験および発育阻害実験を試みたところ、顕著な凝集や発育阻害はみられなかった。
一方、チョウザメについては、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子断片を用いてファージディスプレイライブラリーを構築し、2種類のタンパク質および2種類の病原微生物に対する特異抗体についてバイオパニング法による選別を試みた。バイオパニングを5回繰り返したところ、スカシガイヘモシアニンおよびニワトリ卵白リゾチームに対してライブラリーの結合能が若干上昇した。しかしながら、ブロッキング剤を変更したところ結合力が抑えられたことから、特異的に結合するクローンの濃縮は顕著では無いことが示された。
さらにコイを対象に、異なる水温における抗体産生を調べたところ、水温の上昇とともに自然抗体量は上昇するものの、そのような自然抗体が病原微生物には結合しないことを明らかとした。また、いくつかの魚種を対象に、種々のタンパク質や病原微生物を用いて免疫を試みたが、硬骨魚は非特異的に抗原に結合する自然抗体を多く持つことから、詳細な解析のためには特異抗体の結合反応のみを解析できるような手法を開発する必要があると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、ドチザメ血清中に存在する自然抗体は飼育環境により抗原に結合する能力に違いがあることを示すとともに、その結合が幅広い抗原を認識していることを確認した。このように、タンパク質レベルでの解析は順調に進展しているが、ドチザメ抗体の個々の抗原に対する親和性の強さや特異性については詳細な解析が今後も必要である。さらに、ドチザメの抗体は種々の病原微生物に結合することを確認しているが、これらの微生物の働きを阻害することは確認できなかった。
一方、ファージディスプレイ法を利用して、チョウザメ抗体遺伝子より、抗原特異的なクローン選別のためのライブラリーを作製した。得られたライブラリーにはKLHおよびHELを抗原とする抗体が含まれていることが示唆されたものの、バイオパニング法を用いた選別では顕著な結合力の上昇を見ることができなかった。これはライブラリー作製に用いた臓器が白血球であったため血中の抗体に対応する遺伝子クローンを網羅できていなかった可能性が考えられた。今後、同様の実験をドチザメでも行うに当たり、適切な臓器の選択も含め検討する予定である。
免疫により特異的な抗体を産生することができる硬骨魚においても、自然抗体は高濃度で存在するが、その量は個体の生理状態で大きく変化することを示した。また、硬骨魚の自然抗体は非特異的に様々な分子や成分に結合するため、これまでにいくつかのタンパク質成分を抗原として用い魚を免疫した場合、抗体価の顕著な上昇をみることができないことがあった。したがって、自然抗体と特異抗体の違いを識別しているかどうかについても検討する。
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| Strategy for Future Research Activity |
ドチザメおよびチョウザメの抗体は種々の病原微生物やタンパク質に結合するがその結合様式は不明である。病原微生物に対して顕著な凝集活性を示さなかったことからも、通常の抗原-抗体反応とは異なる分子間相互作用により結合している可能性も考えられるため、特定のタンパク質を抗原としたアフィニティークロマトグラフィー法により抗原特異的な抗体を精製し、その結合様式を詳細に解析する必要がある。
また、チョウザメ抗体遺伝子を用いたファージディスプレイ法による解析でも、ライブラリーと抗原として用いた成分との組み合わせによっては結合が見られたが、バイオパニング法により抗原特異的なクローンの濃縮ができなかったことから、抗体産生臓器を用いた抗体遺伝子配列多様性の評価を行っていく必要があると考えられる。
軟骨魚類やチョウザメ類では、免疫により抗体価が上昇したとされる報告がいくつかあるが、免疫から3ヶ月以上といずれも非常に長い時間をかけ、複数回の免疫を経て抗体価の上昇がみられている。このような特異抗体が本当に産生されるのかどうかを調べるため、比較的飼育も容易なチョウザメを対象に免疫実験を行うとともに、可能であればドチザメについても免疫を試みる。
さらに、硬骨魚の自然抗体には特異性はないものの、その血中濃度は生理状態により変化することを明らかとした。また、特異抗体価の変化も様々な環境要因により影響を受けることから、ドチザメやチョウザメの解析結果から得られた情報を元に、抗体産生機構の比較解析を試みる。
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