2020 Fiscal Year Annual Research Report
Application of natural antibodies from cartilaginous fish
| Project/Area Number |
18H03958
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
近藤 秀裕 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (20314635)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
廣野 育生 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (00270926)
羽生 義郎 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (20357792)
筒井 繁行 北里大学, 海洋生命科学部, 准教授 (20406911)
矢澤 良輔 東京海洋大学, 学術研究院, 准教授 (70625863)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 魚介類免疫 / バイオテクノロジー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はドチザメおよびチョウザメを対象に、各魚種由来の抗体の抗原親和性およびエピトープを解析することを目的として、抗体遺伝子を用いたファージディスプレイプレイライブラリーを構築し、バイオパニング法によるスクリーニングを試みた。しかしながら、いずれも顕著な結合を示すクローンを得るには至らなかった。一方、ドチザメを組み換えウイルス抗原で免疫したものの、顕著な抗体価の上昇は見られなかったが、チョウザメをウシIgGで免疫したところ、免疫一月後に顕著な抗体価の上昇が確認された。
また、ドチザメについて抗体産生組織を解析する目的で、次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトームデータを精査したところ、本魚種では肝臓で抗体産生が顕著であることが示された。さらに肝臓では、抗体重鎖遺伝子と高いアミノ酸同一率を示すものの、多様性領域にあたる配列に組み換えに関わるVDJ配列を持たないユニークな分子が発現していることを見いだした。さらに肝臓では、他の脊椎動物と同様にリゾチームなどの抗菌タンパク質の産生も盛んであった。しかしながら、ドチザメ血清中のタンパク質は50％以上がIgMであり、肝臓由来のタンパク質の割合は少なかった。
本年度はさらにヒラメを用い、サイトカインが抗体産生に及ぼす影響を調べるため、種々の病原微生物分子パターン（PAMPs）としてペプチドグリカンおよびpolyICを用い、組換えタンパク質抗原とPAMPsを組み合わせて投与した場合の抗体価の変化を解析した。組換えタンパク質抗原に対する抗体価は、本タンパク質のみを投与した場合と比べてペプチドグリカンを混合投与した場合に高くなり、polyICを混合投与した場合に低くなった。polyICを投与した区でのみI型インターフェロン遺伝子の遺伝子発現が見られたことから、本サイトカインの抗体産生に及ぼす効果について興味が持たれた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの試験では、ドチザメについては、自然抗体が病原微生物を認識するもののタンパク質抗原に対する結合はあまり見られず、病原微生物に対する結合も直接的に比較できないもののチョウザメのものよりも低い傾向にあった。さらにドチザメについては免疫により抗原特異的な抗体が産生されることはなかった。一方、チョウザメは自然抗体が病原微生物を含む様々な分子を認識するが、ウシIgGを用いて免疫した試験において非免疫魚では抗原に対する抗体はみられず、免疫によってのみ抗原に対する抗体価が上昇することが示された。さらに、これらの魚種由来血清は病原微生物を凝集させることはなかったことから、これらの血中抗体を直接魚病対策に用いることは難しいことが示唆された。
本年度は昨年に引き続き、ファージディスプレイ法を用いた解析を行ったものの、抗原特異的に反応するドチザメおよびチョウザメ由来の抗体遺伝子を単離するには至っていない。したがって、これらの魚種がもつ自然抗体は免疫に寄らず様々な抗原を認識するものの、その結合様式を明らかにするには至っていない。しかしながら本研究により、これらの魚種がもつ抗体分子が他の硬骨魚の抗体と共通の構造を持つことが示された。
本研究により、ドチザメは肝臓において多量の抗体を産生していることが示された。軟骨魚類と同様に血中タンパク質に対する抗体の割合が高いチョウザメにおいても、肝臓での抗体遺伝子の発現が見られる。肝臓は血中のタンパク質を多量に産生する臓器であることから、これらの魚種において肝臓は抗体産生の重要な役割を担う可能性が示唆された。
さらに本研究では、硬骨魚の抗体産生に及ぼす環境およびサイトカインの影響を明らかとした。これらの成果は、進化の過程で魚類の抗体産生がどのように変化してきたかを調べる上で重要な知見である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
ドチザメについては、自然抗体が様々な病原微生物を認識するものの、その結合力はそれほど高くないと考えられる。また、ドチザメ血中のIgMには5量体と単量体があるものの、これらが病原微生物の認識にどのように関わるのかについては不明である。一方、チョウザメの自然抗体はタンパク質抗原を含め様々な分子や病原微生物を認識するものの、認識できない分子があることも明らかとなりつつある。このようなタンパク質レベルでの血中IgMの詳細な性状解析を進める必要がある。
一方、チョウザメについてはこれまで自然抗体に着目して研究を進めてきたが、他の硬骨魚と同様に免疫によって抗体価が上昇することが明らかとなったことから、他の硬骨魚の抗体も含め、ドチザメで得られた血中抗体分子の基礎的知見と比較した際の違いについて、特にタンパク質レベルでの解析を進めていく。とくにこれまで軟骨魚類およびチョウザメの血中IgMを解析する課程で、これらが異なる数の単量体からなるいくつかの多量体を構成することが示されている。このような多量体構造と抗原結合性についていくつかの魚種で比較していく。
またドチザメでは肝臓が抗体産生における重要な器官である可能性が示された。ドチザメ肝臓の抗体産生における役割を明らかとするため、組織切片観察を含めた解析を行うとともに、肝臓の進化的な機能の変化について明らかとすることで、広く魚類の血中タンパク質産生がどのように変わってきたかを明らかとしたい。
さらに、硬骨魚を用いた研究では、環境やPAMPsなどの免疫賦活剤が抗体産生に及ぼす影響を解析してきたが、これらが特異抗体および自然抗体の産生にそれぞれどのように関与するかを明らかとすることで、抗体の魚類生体防御における重要性についてさらに詳しい知見を得ることが求められる。
|
