2020 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of molecular mechanism of translational control by RNA-protein complexes in living cells
| Project/Area Number |
18H03981
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
船津 高志 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 教授 (00190124)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | １分子計測（SMD） / ナノバイオ / 磁気ピンセット / 温度生物学 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
DNA に蓄えられた遺伝情報は一時的にmRNA にコピーされ、リボソームによってタンパク質に翻訳される。翻訳の制御は、生命活動の根幹に関わる重要なプロセスである。本研究では、新たな遺伝子発現制御機構として注目されている以下の３つの翻訳発現制御について、翻訳制御の分子機構を明らかにする。本年度の研究成果は以下の通りである。
１．miRNA による遺伝子発現制御 蛍光標識したlet-7a-1 miRNA前駆体を細胞にマイクロインジェクションし、１分子蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ブラウン運動するlet-7a-1 miRNAとともに、細胞骨格に沿って運動するものが観察された。
２．翻訳アレストによる遺伝子発現制御 N末端にtetracysteine タグを付与したTnaCを再構成型無細胞翻訳系(PURE system) で合成し、その産物を中性条件下のSDS-PAGE により分離した。翻訳がアレストされると、翻訳終結産物（TC-TnaC）とともに、翻訳途上産物が検出された。意外なことに、0.5mM トリプトファン存在下では、これらの産物とともに、TC-TnaC よりも質量が大きな産物が検出された。解析の結果、翻訳アレストが+1フレームシフトにより解除されることが明らかになった 。
３．ストレス顆粒による遺伝子発現制御 細胞内において液-液相分離（LLPS）により駆動される種々の細胞機能の制御機構は不明である。LLPS の詳細な形成メカニズムを知るためには、LLPS を生きた細胞内で観察する新しい方法が必要である。TIAl を過剰発現させることによって細胞内で形成される顆粒はLLPSにより維持されることを確認した。このLLPS 観察法を用いることで、TIAl 顆粒の形成には従来から知られた化学シグナル伝達ではなく細胞内の温度勾配が寄与していることが分かった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．miRNA による遺伝子発現制御 蛍光標識したlet-7a-1 miRNA前駆体を細胞にマイクロインジェクションし、１分子蛍光顕微鏡で観察することに成功した。
２．翻訳アレストによる遺伝子発現制御 N末端にtetracysteine タグを付与したTnaCを再構成型無細胞翻訳系(PURE system) で合成し、その産物を中性条件下のSDS-PAGE により分離・解析した結果、TnaCの翻訳アレストが+1フレームシフトにより解除されることを明らかにした。
３．ストレス顆粒による遺伝子発現制御 TIAl を過剰発現させることによって細胞内で形成される顆粒はLLPSにより維持されることを確認した。このLLPS 観察法を用いることで、TIAl 顆粒の形成には従来から知られた化学シグナル伝達ではなく細胞内の温度勾配が寄与していることが分かった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
１．miRNA による遺伝子発現制御 蛍光相関分光法と蛍光相互相関分光法を用いて 導入した miRNA の拡散を定量することにより、細胞内での miRNAの状態を明らかにする。
２．翻訳アレストによる遺伝子発現制御 磁気ピンセットによるSecM 翻訳アレスト複合体への張力負荷と翻訳再開を実証する。ジゴキシゲニンを付加したssDNAを結合させた長鎖のmRNA を鋳型として、N 末端にHaloTag を融合したSecM（HaloTag-SecM）をHaloTag PEG BiotinLigand 存在下でin vitro 合成する。翻訳アレスト複合体に抗ジゴキシゲニン抗体・ストレプトアビジンを介して2 つのマイクロビーズを結合させ、磁気ピンセットを利用して新生SecM 鎖に負荷を加える。翻訳アレストが解除されて翻訳が再開されることを、マイクロビーズの動きをナノメートル計測することにより証明する。
３．ストレス顆粒による遺伝子発現制御 SG の形成機構の解明と超微細構造の観察を行う。培養細胞のmRNA を、2’-O-methyl 化オリゴRNA を用いて蛍光標識し、SGの構成タンパク質であるG3BO、TIA1 、GTPBP2などを別の蛍光色素で２重染色する。培養細胞に0.5 mM sodium arsenite による酸化ストレスを負荷し、２種類の蛍光色素の分布を超解像顕微鏡観察し、SG の形成機構とストレスの解除に伴うSG の崩壊過程を明らかにする。さらに、mRNAの運動を１分子レベルで解析し、SGの内部微細構造とmRNAの運動性の関係を明らかにする。
|
