2020 Fiscal Year Annual Research Report
ATP依存性リコンビナーゼによるDNA鎖交換反応の統合的理解
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18H03985
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
岩崎 博史 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (60232659)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 相同組換え / Rad51 / Dmc1 / Swi5-Sfr1 複合体 / Hop2-Mnd1 複合体 / リアルタイムアッセイ / MRN複合体 / DNA 二重鎖切断 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
相同組換えの中心反応は、ATPをコファクターとするRecA ファミリーリコンビナーゼ（ATP依存的組換え酵素）によるDNA鎖交換反応である。このファミリータンパク質は、まず、単鎖(ssDNA)と数珠状に結合したプレシナプティックフィラメントを形成し、ドナー二重鎖DNA(dsDNA)に対する相同性検索とDNA鎖の交換を行う。本申請研究では、様々な代表的ATP依存的組換え酵素について普遍性と特異性の検証、相同性認識におけるストリンジェンシー制御機構と補助因子による活性化機構を明らかにすることを目的としている。当該年度は、次の成果を得た。
(1)Rad51 によるDNA鎖交換反応の分子機構解析を行いDNA結合モチーフ（第1 DNA結合部位内の２つのループ及び第２ DNA結合部位）の機能を明らかにした(Ito et al, Nat comm)。
(2)分裂酵母Swi5-Sfr1とRad51の相互作用の解析を行い、Swi5-Sfr1がRad55-Rad57を介してRad51にリクルートされる新規機構を明らかにした(Argunhan et al, eLife)。
(3)分裂酵母の減数分裂特異的リコンビナーゼDmc1の反応機構解析を行い、2種類の補助因子Swi5-Sfr1とHop2-Mnd1は、全く異なる機構でDmc1を活性化しており、この二つの補助因子が段階的に互いを補うようにDmc1のDNA鎖交換反応を促進することを明らかにした (Tsubouchi et al, PNAS)。
(4)担子菌酵母Naganishia Liquefaciensのドラフトゲノムを決定し、Rad51を始めとする相同組換えに関与する遺伝子群を解明した（Han et al, MRA）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
主に次の3つのプロジェクトを遂行している。
（１）Rad51の表面上の電荷の解析から、E205, E206及びD209がprotruding acidic patch(PAPと命名)を形成していることを見出した。様々な解析から、PAPとFxxAモチーフがRad52、Rad54, Rad55-Rad57相互作用に重要なモチーフであることがわかりつつある。
（２）Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN)-Ctp1複合体は、相同組換え(HR)によってDNA二本鎖切断(DSB)を修復するために重要なMre11エンドヌクレアーゼコアとする生体超分子である。我々は、Ctp1リン酸化がCtp1とNbs1の関連を誘発することによってMre11エンドヌクレアーゼ活性が刺激されることを見出した。重要なことに、Ctp1のC末端15アミノ酸からなるポリペプチドのみでエンドヌクレアーゼ活性を刺激するのに十分であることを明らかにした。さらに、ヒトの場合でも同様にhCT15はMre11エンドヌクレアーゼ活性を刺激し、この刺激メカニズムの一般性を主張した。
（３）Rrp1は、Rad51のメディエーターの一つである。Rrp1の過剰生産はRad51過剰発現による毒性を軽減した。In vitroの解析から、Rrp1は二本鎖DNAからRad51を除去するトランスロケースであることを見出した。さらに、Rrp1がRrp51を基質とするE3ユビキチンリガーゼ活性を有することをin vivoおよびin vitroで実証し、Rrp1がRad51を多層的に調節することを示した。
これらの成果は、当初の計画以上に伸展していると評価される。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述の研究において、未完部分を完成させるとともに、次の3つのプロジェクトを推進する。
1）分裂酵母Swi5-Sfr1とRad51の相互作用の解析：Rad51-Swi5-Sfr1フィラメントの構造についてクライオ電顕を用いて解析する。また、Swi5-Sfr1がRad55-Rad57と高次複合体を形成すること、また、Shu 複合体もRad55-Rad57複合体と相互作用することが予想される。これらのタンパク質の相互作用の生物学的意味について、これらのタンパク質を精製して試験管内で再構成系を構築して解析する。
2）普遍性と特異性：ヒトBRCA2は家族性乳がんの原因遺伝子であり、ヒトRAD51の促進因子として知られている。我々は、担子菌酵母Naganishia のBRCA2ホモログを明らかにしている。Naganishia 酵母をモデル系として、BRCA2のRad51に対する促進効果について、生化学的に詳細な解析を行う。また、我々が開発したリアルタイムアッセイ系を用いてダイナミズムを詳細に解析する。
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[Presentation] Activation of Mre11-Rad50-Nbs1 Endonuclease by the Ctp1 C-terminal Peptide Initiates DNA Double-Strand Break Repair via Homologous Recombination2020
Author(s)
Zdravkovic A, Daley JM, Niwa T, Murayama Y, Kanamaru S, Ito K, Maki T, Takahashi M, Tsubouchi H, Sung P, Iwasaki H.
Organizer
1st Congress of South Eastern European Biological and Regenerative Medicine Association
Int'l Joint Research / Invited
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