2018 Fiscal Year Annual Research Report
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18H03987
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
永井 健治 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20311350)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 温度生物学 / ジュール熱仮説 / 蛍光タンパク質 / フェルスター共鳴エネルギー移動 / 高分子ゲル / 蛍光比イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、細胞の生体膜上のチャネルタンパク質における電気化学ポテンシャルで駆動されたイオン流によってジュール熱が発生し、細胞生理機能に関与する酵素活性がこの熱によって調節を受けるという「ジュール熱仮説」を検証することである。今年度は、チャネルタンパク質において発生するイオン流による微小なジュール熱発生を検出することを狙い、高感度な蛍光性温度プローブの開発を目指して試作検討を行った。特に、有望な温度プローブの候補として、(1)異なる蛍光波長帯を有する2つの蛍光タンパク質で構成されるフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)の原理を用いたFRET型温度プローブ、(2)２つの蛍光タンパク質とそれらを架橋するポリペプチド鎖から構成される高分子ゲル様温度感受性を利用したポリペプチドリンカー型温度プローブ、そして(3)温度依存性の2つの吸収帯を持つ2吸収帯型温度プローブの開発に着手した。FRET型温度プローブでは、光スイッチング蛍光タンパク質をドナーに用いることで温度超解像イメージングを狙い、ビルディングブロックとして用いる蛍光タンパク質として様々な組み合わせを試作検討した。その結果、試作したプローブにおいて、FRET、温度感受性、そして光スイッチング能を示すプローブの作製に成功した。ポリペプチドリンカー型温度プローブでは、構成要素である2つの蛍光タンパク質と、それらを架橋するポリペプチド鎖の様々な組み合わせを試作して特性評価を行い、高分子ゲル様の急峻な温度感受性を示すプローブの作製に成功した。2吸収帯型温度プローブは、既存の蛍光タンパク質にランダム変異導入とスクリーニングのサイクルを多段階で行うことで、温度感受性を示すプローブの作製を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画では、温度プローブの開発を行う予定であった。本研究で開発を目指した温度プローブに課した要件は、(A)自家蛍光や光毒性を避けるために、可視光域のできるだけ長い波長の励起波長を有すること、(B)高い温度感受性を有すること、そして(C)温度の絶対値測定のために蛍光比測定によって温度決定が可能なことである。今年度は、(1)異なる蛍光波長帯を有する2つの蛍光タンパク質で構成されるフェルスターエネルギー移動原理を用いたFRET型温度プローブ、(2)２つの蛍光タンパク質とそれらを架橋するポリペプチド鎖から構成される高分子ゲル様温度依存性相転移を利用したポリペプチドリンカー型温度プローブ、そして(3)温度依存性の2つの吸収帯を持つ2吸収帯型温度プローブの開発に着手した。これらはいずれも、可視光域の励起波長・蛍光波長をもち、蛍光比で温度決定をするタイプのプローブである。また、実験結果は予備的であるが、ポリペプチドリンカー型温度プローブと2吸収帯型温度プローブは、バイオイメージングで使用された温度プローブではかつてないくらいに高感度な温度感受性を得ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、フェルスターエネルギー移動型温度プローブ、２つの蛍光タンパク質とポリペプチド鎖から構成される高分子の温度感受性を利用した温度プローブ、そして温度依存性の2つの吸収帯を持つ温度プローブの開発に着手した。次年度は、これらの温度プローブの特性改良を試験管内分子進化手法で行う。具体的には、(1)温度変化に対するシグナルの変化率の大きいこと、(2)測定することが望ましい温度範囲で温度応答を示すこと、(3)蛍光強度が高いこと、(4)発色団のMaturaionの速いこと、(5)プローブ同士の会合によって多量体化しないこと、そして(6)様々な妨害因子との交叉反応が少ないことを検討項目として、特性改良を進める。
さらに、以上のように開発する蛍光性温度プローブを用いて細胞の温度計測に着手する。まずは、開発した蛍光性温度プローブが細胞内で温度プローブとして機能するかを検証する。これには、蛍光顕微鏡で観察下の培養細胞の培地温度を精密に制御し、細胞内に発現させた蛍光性温度プローブから得られるシグナルを測定して校正データを得る。さらに、光照射によって発熱するミクロン～サブミクロンサイズの発熱体を顕微鏡観察の試料に導入し、蛍光顕微鏡の観察中に発熱体に光照射をして発熱させることで、実時間で局所的な温度変化検出を検証する。次に、「ジュール熱仮説」検証のための温度計測として、生体膜を介してイオン流を発生させるタンパク質での温度計測に着手する。特に、ミトコンドリア膜の水素イオン流による熱産生や、細胞の刺激に伴う蛍光性温度プローブ融合チャネルタンパク質のチャネル電流に伴う熱産生を蛍光顕微鏡観察で解析する。
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