2020 Fiscal Year Annual Research Report
異種移植モデルの由来組織別エクソソミクスに着目した革新的癌診断治療シーズの開発
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18H04064
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
小川 修 京都大学, 医学研究科, 教授 (90260611)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
赤松 秀輔 京都大学, 医学研究科, 講師 (20767248)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | エクソソーム / 泌尿器 / 癌 / 患者癌組織由来ゼノグラフト / 薬剤抵抗性 / 転移形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
転移形成機序の解明については、腎細胞癌骨転移の臨床検体から安定継代できるPDXを樹立することができた。また、骨でのin vivo selectionによって骨転移指向性を高めた細胞株の培養上清から回収したエクソソームのタンパクを、親株のそれとLCMSにて網羅的に比較検討した結果、タンパクのプロファイルが異なるという結果が得られた。骨転移指向性の細胞株由来エクソソーム中で発現が上昇しているタンパクのうち、細胞懸濁液と比較してエクソソームでより濃縮されているということからAminopeptidase N/CD13に注目した。加えて、このエクソソームをヌードマウスに静脈注射して経過を観察したところ、骨髄の組織学的所見に変化を認めた。In vitroにおいても、CD13をノックダウンした細胞株で変化の抑制を認めた。
薬剤抵抗性機序の研究については、スニチニブ耐性PDXモデル(KURC1)を樹立し、その新鮮組織培養液からエクソソームを回収する系を確立した。in vivoにおいて、腫瘍表面にエクソソームを注射すると腫瘍組織内にエクソソームが取り込まれることも確認できた。 また、スニチニブ耐性モデル、感受性モデルの新鮮組織由来エクソソームに含まれるmiRNAの解析を行った。この結果、スニチニブ耐性モデル由来エクソソームで有意に発現が上昇しているmiRNAのうち、癌の悪性化や進展に関わるものとしてmiR-494-3p、miR-29a-3pに注目した。これらのmiRNAの標的遺伝子とされるPTENやTET1はスニチニブ耐性腫瘍において感受性腫瘍より発現が低下していることがタンパクレベルで示された。さらにTET1についてはスニチニブ耐性モデル由来エクソソームを腎癌細胞株Caki-1に添加すると発現が低下す
るという結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
転移形成機序の解明については、昨年度までの研究で骨指向性を高めた細胞株から抽出したエクソソームで骨髄を変性させること、またLCMS解析から注目したCD13をノックダウンすることでin vitroにおいて変化を抑制させることが確認できている。In vivoの検証と臨床検体の検証を追加予定であり、おおむね予定通りある。
一方薬剤抵抗性の研究については、耐性モデル腫瘍由来エクソソーム中で発現上昇しているmiRAN中から癌の悪性化や進展に関わるものが同定された。スクリーニングの部分についてはmiRNAの網羅的解析の結果は出ているものの、臨床検体由来のエクソソームを使った検証には進めておらずやや遅れている。エクソソームのPDXへの投与実験につい
ては、投与条件の設定に苦労しており遅れている。マーカー開発については、今回絞り込んだ候補の検証をこれから開始するところであり、遅れている。
以上から、総合的に勘案して本研究課題全体の進捗状況をやや遅れているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
転移形成機序の研究においては、in vivoで骨指向性を高めた細胞株から抽出したエクソソームを静注することで、腎癌細胞株を心注した際に骨転移が増えるか確認中である。また、CD13をノックダウンした細胞株から得たエクソソームをマウスに投与し、骨髄の変化を抑制するか検証中である。さらに現在、血清・腫瘍を含む臨床検体、PDXにおけるCD13の発現を解析中である。
一方で、腎細胞癌骨転移の臨床検体から安定継代が可能なPDXを樹立している。このPDXから回収したエクソソームが骨髄に同様の作用を有するかを評価する予定である。ヌードマウスにおいて同様に骨髄を変性させるようなフェノタイプを観察できれば、さらに腎細胞癌の細胞株を注射して転移の形成に変化があるかを評価する。
薬剤抵抗性機序の研究については、スニチニブ耐性、感受性それぞれの新鮮組織由来エクソソームを投与することで腫瘍のスニチニブへの感受性が変化するかどうかを観察する予定としている。また、スニチニブ耐性モデル、感受性モデルの新鮮組織由来エクソソームに含まれるmiRNAの解析から、スニチニブ耐性モデル由来エクソソームで有意に発現が上昇しているものに注目し、これらのin vivo、in vitroにおける機能を解析していく予定としている。また、あわせてmRNAの発現も解析することでスニチニブ抵抗性にかかわるシグナルパスウェイの同定を目指す。
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