2018 Fiscal Year Annual Research Report
幹細胞における細胞周期の制御と代謝系との連関に関する総合的研究
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18H05215
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
中山 敬一 九州大学, 生体防御医学研究所, 主幹教授 (80291508)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中山 啓子 東北大学, 医学系研究科, 教授 (60294972)
服部 聡子 (高井聡子) 藤田医科大学, 総合医科学研究所, 助教 (00415564)
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| Project Period (FY) |
2018-04-23 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞周期 / 代謝 / 幹細胞 / プロテオミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず近交系マウス（Mus musculus musculus: C57BL/6J系統）と野生マウス（Mus musculus castaneus系統）のF1におけるアリル特異的なゲノムの立体的区域化 (TAD: topology associating domain) を決定するため、既に公開されているHi-C解析結果のデータベースより解析パイプラインを作成し、実際にアリル特異的なTAD解析を行った。
また幹細胞特異的に変化するTADを制御すると思われるシス領域を決定し、次にその配列を標的とするsgRNAとビオチン化された不活性型Cas9（dCas9）を用いて、免疫沈降したタンパク質（トランス因子）XおよびYを、LC-MS/MSを用いてタンパク質の同定を行うための基礎検討を行った。
さらにDMRのメチル化特異的にTADを変化させるインスレーター結合因子Zを、メチル化/非メチル化DNAアフィニティカラムにおいて結合に差がある分子をLC-MS/MSで同定するための基礎検討も行った。
次にp57遺伝子に蛍光タンパク質Venusを組み込んだ（p57-2a-Venus）細胞株やマウスを作製し、FACSで簡便に遺伝子発現状況を生存下でモニターできる系を構築した。遺伝子発現と相関のあるヒストン修飾部位を標的に、CRISPR/Cas9システムを用いて欠失株を作製し、Venusの発現が低下した株を選別した。その欠失した塩基配列よりプロモーター活性に必要な領域を決定した。
同時に細胞周期と代謝系の関連を調べるために、全代謝酵素の絶対定量技術を開発し、それをさらに改良することによって、幹細胞のように極少数の細胞から精密なタンパク質発現量分析ができるようにした。この技術の開発によって、一匹のマウスから最大数千個しか取れないような成人幹細胞でのプロテオーム解析が可能になった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初期の達成目標であるp57遺伝子のアリル特異的なTAD制御機構について、多くの実験の基礎検討をほぼ終了し、あとは胚性幹細胞（ESC）と成体幹細胞（ASC）で実際のHi-C解析を行うのみになっている。Skp2においても同様である。また細胞周期と代謝系の連関を研究する上で必須な極少数細胞でのプロテオミクス技術の開発も順調に進んでおり、論文を執筆している最中である。この技術の成否がこの研究全体のボトルネックになっているので、そこを早くもクリアできたことは、今後の展開がスムーズに行くことを予想させるものである。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在まで順調に研究が進んでおり、アリル特異的なTAD決定や、p57/Skp2の幹細胞における発現制御機構は近いうちに具体的な成果が得られる予定である。今後は実際のトランス因子X, Y, Zの分子同定を行い、それらをコードする遺伝子の改変動物を作出して、それらトランス因子の生理的役割を明らかにする。さらに開発がほぼ成功した極少数細胞でのプロテオミクス解析についても、実際のマウスから得た数千個レベルの成体幹細胞（ASC）でプロテオーム解析を施行し、その代謝特性を描出する予定である。同様の解析を野生型マウスだけではなく、上記で作成した種々の遺伝子改変マウスで行って、細胞周期制御分子であるp57やSkp2の発現制御機構の変異が、どのように代謝系に影響を与えるかを検討することによって、細胞周期と代謝系の連関機構を明らかにしていく予定である。
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