2021 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the mechanism in the regulation of chondrocyte-specific Runx2 enhancer and development of the drug for osteoarthritis
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18H05283
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
小守 壽文 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
姜 晴 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (00790007)
宮崎 敏博 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10174161)
森石 武史 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (20380983)
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| Project Period (FY) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| Keywords | Runx2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨芽細胞分化後のRunx2の機能を解析するために、骨芽細胞分化後に発現する2.3 kb Col1a1プロモーターCre(Col1a1 Cre)の同じ系統マウスを用いたコンディショナルノックアウトマウスが２グループから報告された。１グループは、完全にRunx2の機能を欠損させたが、表現型はなく、もう一方では、Runx2のDNA結合能を保持し、機能が低下したRunx2タンパク質が形成され、骨量が減少した。これは、この異常なRunx2タンパク質が他のRunx分子を抑制したためと考えられる。したがって、Runx2の骨芽細胞分化後の機能は、未解明であった。
我々は、独自にCol1a1 Creマウスを作製し、Runx2を骨芽細胞分化後に欠失させた。骨量は、海面骨、皮質骨ともに減少し、骨形成は低下した。主要骨基質タンパク質であるCol1a1, Col1a2, Spp1, Ibsp, Bgalap/Bglap2は減少し、Runx2がこれらの遺伝子発現に必要であることを明らかにした。すなわち、骨芽細胞の主要機能である骨基質タンパク質発現に、Runx2は主要な役割を果たしていた。
骨細胞ネットワークは、骨量維持に重要な役割を果たしている。今回、骨の圧迫側と伸展側で、コラーゲン・骨小腔の配向、骨細管数、骨細管幅に差があることを明らかにした。骨の圧迫側では伸展側に比較し、コラーゲン・骨小腔は骨の長軸方向により規則正しく配置し、骨細管は密で細かった。これらは、メカニカルストレスの影響によると考えられた。さらに、骨小腔・骨細管構造の異常を持つ骨芽細胞特異的Sp7トランスジェニックマウスを解析し、骨細管の連結した骨細胞ネットワークは、非荷重時の反応を起こすに十分であるが、正常な骨細胞ネットワークが、非荷重時の圧迫・伸展側での異なるSost発現誘導および非荷重時の骨形成抑制からの回復に必要なことを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Runx2は、間葉系幹細胞から骨芽細胞系列への分化を決定し、骨芽細胞前駆細胞の増殖を促進させる。そして、未熟骨芽細胞へと分化させることを明らかにしてきた。しかし、骨芽細胞分化後のRunx2の機能は、解明されていなかった。Col1a1 Creを用いたコンディショナルノックアウトマウスは発表されていたが、同じCreマウスを用いていながら、完全にRunx2機能を破壊したマウスの方が表現型を認めないという結果になった。これは、Creマウスの効率が悪いことに起因すると考えられた。そこでGFP-Cre融合タンパク質によりCreの発現パターンも確認できるCol1a1 GFP-Creマウスを独自に作製し、Runx2を骨芽細胞分化後に完全に機能消失させた。このCreマウスを用いることにより、Runx2が主要な骨基質タンパク質遺伝子発現に重要な役割を果たすことを明らかにした。よって、Runx2の機能解析は順調に進展している。
骨細胞は、その細胞突起によって周辺の骨細胞や骨芽細胞とギャップ結合により連結されるとともに骨細管によって連結されている。そして、細管内の突起がシェアストレスを感知し、力学的ストレスに応答すると考えられている。骨小腔、骨細管を詳細に観察することにより、皮質骨の圧縮側と伸展側で、その構造に違いがあることを明らかにした。これは、骨の形成過程において、力学的ストレスによって骨の微細構造が決定されることを明らかにしたものであり、学術的意義が非常に高い。さらに骨小腔・骨細管構造が異常なマウスを解析することにより、力学的ストレス応答における骨細胞ネットワーク構造の必要条件および正常の骨細胞ネットワークの新たな機能を明らかにした。よって、骨細胞と力学的ストレスに関する研究は順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）II型コラーゲンプロモーターを用いたCol2a1-GFPマウスよりGFP陽性細胞（静止軟骨細胞および増殖軟骨細胞）を分離する。X型コラーゲンプロモーターを用いたCo10a1-Creマウス、Rosa26-CAG-loxP-mTFPマウス、I型コラーゲンプロモーターを用いたCol1a1-tomatoマウスを交配し、Co10a1-Cre-Rosa-tomatoマウスを作製する。このマウスでは、肥大軟骨細胞でmTFP（青緑色)、軟骨細胞から分化転換した骨芽細胞ではmTFPとtomatoの両者（白色）、その他の骨芽細胞ではtomatoのみ（赤色）を発現する。これらをFACSで分離採取する。1細胞完全長トータルRNAシーケンスにより、単一細胞レベルで網羅的遺伝子発現およびエンハンサーRNA発現を定量し、骨芽細胞・軟骨細胞の各分化段階マーカー遺伝子（分化段階の特定）とエンハンサーRNA（活性化エンハンサーの特定）の発現定量を行い、各分化段階で活性化されるエンハンサーを同定する。
２）上記で特定した活性化エンハンサーは、GFPレポーターマウスを作製する。凍結切片を作成し、GFPの蛍光観察を行う。骨芽細胞、軟骨細胞あるいはその両者に特異的にGFP発現を確認できたエンハンサーを選択する。
３）選択したエンハンサー候補領域は、CRISPR/Cas3の系を用い、複数の候補を同時に欠失させたマウスを作製する。ホモ欠損マウスを作製後、軟骨細胞の成熟、軟骨内骨化、膜性骨化を野生型マウスと比較評価する。また、Runx2 mRNAを定量し野生型マウスと比較する。これらにより、生理的に重要なエンハンサー群を特定する。
４）天然化合物ライブラリースクリーニングで軟骨細胞特異的エンハンサーを抑制した化合物の軟骨細胞分化における作用、毒性、濃度依存性を調べる。
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