2018 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of a novel strategy for pathological analysis of multifactorial diseases using genetic risk variants
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18H05285
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
山本 一彦 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 副センター長 (80191394)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 亜香里 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 副チームリーダー (00391996)
庄田 宏文 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (20529036)
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| Project Period (FY) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| Keywords | eQTL解析 / プロモーターエンハンサー解析 / 免疫細胞分画 / クロマチン構造解析 / 遺伝子発現量解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、「ゲノム要因は疾患に対して因果関係を明示する」という原理に基いて、ヒトの多因子疾患研究において、因果関係を持つ中間形質を特定するための方法論を確立することである。本研究では免疫系が関与する疾病を対象に、多因子疾患における疾患リスク多型の多くが、遺伝子発現やスプライシングに影響を与える遺伝子多型であるという最近の知見を基にして、遺伝子発現、エピゲノム変化、蛋白発現、細胞変化などの中間形質の中から、疾患成立や進展に対して因果関係をもつ要素を同定し、このような確実な情報をもとに病態の理解と新しい治療法開発の方向へ展開できるシステムを構築する。このシステムが構築できれば、免疫疾患以外の多因子疾患への応用が可能となると期待できる。システム構築のため、健常人ボランティアから50mlの末梢血を採取し、単核球（PBMC）に分離し、25種類のサブセットに効率よく分離するシステムを構築した。それらの細胞からRNAを抽出し、発現RNA測定のためのRNA-seq法、オープンクロマチンの検出のためのATAC-seq法、5’末の転写開始点を正確に検出するためのCAGE法に向けた処理をして、それぞれ次世代シークエン
サーにてシグナルを解析するために必要最小限の細胞数を同定し、実際にライブラリ構築が可能であることを確認した。一方、PBMCよりDNAを採取し、アジア人向けに開発されたアレイで一塩基多型を解析するため、ゲノムの抽出を実施した。RNA-seq, ATAC-seq,CAGEにて得られたシグナルをリファレンスゲノムにマッピングし、免疫が関与する種々の疾患リスクゲノム多型との関係を、発現に関する量的形質遺伝子座（eQTL）解析を並行して行いながらそれらを統合し、リスク多型が特定の免疫担当細胞サブセット特異的な機能変化に及ぼしている遺伝子領域を特定しするための解析フローを作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒトの免疫システムに関与する免疫担当細胞サブセット毎の遺伝子発現と遺伝子多型の関係に関するデータを構築することを目標に研究システムの構築を開始した。発症後の病態や治療による修飾を避け、遺伝子多型とそれによる遺伝子発現やスプライシング変化およびエピゲノム変化の情報を得る理由から、健常人の末梢血を主な解析対象として、免疫担当細胞の20程度のサブセットにセルソーターで分離したのち、細胞の遺伝子発現解析を次世代シークエンサーにて行うことを主な研究手法とした。さらに網羅的なオープンクロマチンの解析（ATAC seq）も並行して行うことにした。これらのデータを解析対象の免疫が関与する各種疾患における疾患リスク多型を免疫担当サブセット毎の多型・発現・エピゲノムカタログと統合し、疾患において因果関係をもって関与する細胞、その細胞での遺伝子発現とその調節機構の検討を行う予定である。これらの研究計画を記載して倫理委員会に申請をした。しかし、新しい倫理指針の改定を含め、内容照会などのやり取りなどに時間を要した。さらに、研究開始時にセルソーターの機械的なトラブルが発生し、予備的検討の時間が２か月ほど遅延したが、遅れは解消し、順調に検体収集は行われている。約30サブセットの細胞を収集を進め、まずは遺伝子発現やスプライシング変化と遺伝子多型の関連をカタログ化を目指している。同時に採取しているRNAをもちい、CAGE-seqを行うことで、エピゲノム情報の一つである、エンハンサープロモーター解析が可能となる。現在、それらの詳細な解析手法を構築するためのテスト実験を並行して実施している。これにより、解析対象疾患における疾患リスク多型を免疫担当サブセット毎の多型・発現・エピゲノムカタログと統合し、疾患において因果関係をもって関与する細胞、その細胞での遺伝子発現とその調節機構の検討も開始する。
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| Strategy for Future Research Activity |
多因子疾患のリスク多型の多く(50-80%)はプロモーターやエンハンサーなどの遺伝子発現調節領域にあると考えられ、これらは eQTLやスプライシングの違いを生じる遺伝子座 (splicing QTL: sQTL)の原因であることが明らかになりつつある。特にこれらの多くは、特定の細胞で働いていることも判明している。ただし、エンハンサー活性を持つ領域は未だに不明なものも多く、組織、細胞サブセットごとの網羅的な情報が必要である。例えば、リスク多型とDNAメチル化パターンの関係は、免疫細胞機能の疾患状態への変化に大きな影響を与えていると考えられる。このようにゲノムワイド関連解析（GWAS）だけでは分からないリスク多型の疾患への影響を、様々な細胞内の状態変化を組み合わせて全体像として捉えることが疾患発症メカニズム解明に重要と考える。
ヒト免疫システムに関わる免疫細胞として、各個人の末梢血より血球細胞を28種類のサブセットに分画するための手法を確立し、PBMCと合わせ、29種類のサンプルを収集している。本研究課題ではこれまでほとんど解析対象となっていなかった、プロモーターエンハンサー解析とジェノタイプの関係を調べるための解析手法の開発を行っている。そのためには、従来のCAGE-seqの手法ではRNAの量がかなり不足するため、微量検体を用いた、CAGE-seqの開発を行っている。本年度は昨年度まで継続しているセルソーターで血球細胞を分画を継続的に実施する。分画した細胞は、それぞれ、ホールトランスクリプトーム解析、スプライシングプロモーターエンハンサー解析、クロマチンステイタス解析を行い、同一検体のジェノタイピング情報を加え、QTL解析を行う。同一検体を用いてCAGE-Seqを実施し、これにより、疾患において因果関係をもって関与する細胞での遺伝子調節機構の解明する。
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