2020 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of a novel strategy for pathological analysis of multifactorial diseases using genetic risk variants
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18H05285
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
山本 一彦 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, チームリーダー (80191394)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 亜香里 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 副チームリーダー (00391996)
庄田 宏文 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (20529036)
尾崎 浩一 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, メディカルゲノムセンター, 部長 (50373288)
寺尾 知可史 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, チームリーダー (60610459)
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| Project Period (FY) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| Keywords | QTL解析 / 免疫細胞分画 / 疾患関連遺伝子多型 / 遺伝子発現量解析 / プロモーターエンハンサー解析 / オープンクロマチン解析 / シングルセル解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
健常人末梢血より27リンパ球サブセットと好中球、末梢血単核球（PBMC）を合わせ、29種類のサンプルを75名分取得し、RNA-Seq法によるトランスクリプトーム解析、ATAC-Seq法によるオープンクロマチン解析を実施した。遺伝子変異（ジェノタイプ）についてはイルミナ社のアジア人用に調整されているアジアン・アレイを解析に用いた。これらのデータはすべて取得済みであり、現在データ解析を進めている。まずはオープンクロマチン解析の結果より、29種類の細胞サブセットはそれぞれの細胞特異性を示す領域、細胞間で共有される領域が存在しており、オープンクロマチン状態とジェノタイプの関連を検出精度の高いRASQUAL法を用いて調べたところ、特に好中球では他細胞と比べて明らかにジェノタイプと関連する領域が少ない、という結果が得られている。さらにオープンクロマチン領域の情報とトランスクリプトーム解析のデータを統合することで、遺伝子の転写調節と各細胞における特異性の関連を明らかにするとともに、遺伝子変異との関連を調べることで、これまではっきりしていなかった遺伝子外の非コード領域にある遺伝子変異の機能について、より明確にすることができると考える。さらに、今後これらの解析に用いた同一のサンプルについて、プロモーターおよびエンハンサー解析を実施する。手法としては転写の５’末を正確に把握できるCAGE法を実施する。そのための予備実験で5種類の主要リンパ球サブセット解析を実施した結果、特定の細胞におけるエンハンサーの強さとジェノタイプの間に相関を見出すことに成功しており、今回の29種類のサンプルについても同様に解析を行うことで、これまで機能がよく分からなかった非コード領域に存在する遺伝子変異の機能をより明確にすることが可能になると考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度末から2020年度はコロナ感染症対策のため検体収集、実験の実施ができない時期があったが、2020年度途中より再開し、サブセット解析のための検体を追加した。75名分で一度データ取得とデータ解析を実施しており、今後の収集計画の調整を行う予定である。現在オープンクロマチン解析とトランスクリプトーム解析のデータ取得を終了し、様々な解析を行いつつ、それらの遺伝子変異（ジェノタイプ）との関連、またその統合を行っている。CAGE解析については、回収できる各サブセットの細胞数が多くなく、そこからの抽出できるRNAが数ng程度であることから、従来のCAGE法では解析が難しいため、方法の改良・調整を行い、現在75名分の検体のデータ取得を進めている。現在のサブセット解析は疾患のバイアスが入らない健常人検体を用いているため、基本的には刺激の入っていない、定常状態の情報に限られている。しかし、実際の病態に関与する細胞の状態は刺激によりさまざまに変化することが知られており、この変化が疾患発症につながっている可能性が高い。これらを考慮し、健常人検体由来の細胞に対して刺激を加えた検体の解析を開始した。現在、CD4陽性T細胞とマクロファージについて実験条件の設定とサンプルの収集を行っている。これらの検体を25～50名分、解析手法に合わせて収集を行ない、従来行っているトランスクリプトーム解析、オープンクロマチン解析に加え、CAGE法によるプロモーターおよびエンハンサー解析を行いつつある。CAGE法については、少量のRNAでも解析可能である、nanoCAGE法に加え、プロモーター・エンハンサーの検出感度が高いNET-CAGE法の導入を目指している。
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| Strategy for Future Research Activity |
75名分の29細胞サブセットのデータを用い、どの程度ヒト免疫細胞サブセット別機能が解析できるのか確認し、検出力が不足する場合は追加データ取得を実施する予定である。これらのマルチオミックスデータは末梢血リンパ球のデータとして様々な解析の基礎となる定常状態の情報であり、遺伝子変異と遺伝子発現に関するバイアスの少ない機能的関連を示していると考えられる。一方、疾患発症は定常状態から、疾患の状態へ細胞が変化することに起因すると想定されることから、各細胞に刺激を加えることで、その変化を調べることは疾患の理解の上で重要と考える。一方、今回取得をしつつあるトランスクリプトーム解析、オープンクロマチン解析、プロモーター・エンハンサー解析は多型の機能を直接調べるために重要な解析であるが、染色体の3次元的な構造に対する遺伝子変異の影響については現時点で明確なデータはほとんどない。特にエンハンサーは近位、遠位いずれにも３次元的な影響を及ぼすことが可能であるが、その多くの機能は十分に理解できていない。リスク変異の多くは遺伝子間（intergenic)領域にあり、その多くはエンハンサー領域に存在していることが推定されていることから、その遠位部の相互作用を含めた詳細な機能評価はリスク多型の機能解析上重要である。そこで遺伝子変異とエンハンサーの関連を調べるためにクロマチン相互作用解析を行う予定である。そして最終的には、これらの健常人リンパ球を用いた遺伝子変異と遺伝子発現のデータセットに、各免疫疾患で判明しつつあるリスク変異情報を統合し、各疾患で起こっている免疫細胞機能異常を推定しつつ各疾患で検証し、それを修復する方法を見出すことを本研究の目的とする。
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