2018 Fiscal Year Annual Research Report
Environmental electrophiles exposome and reactive sulfur species as its regulator molecule
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18H05293
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
熊谷 嘉人 筑波大学, 医学医療系, 教授 (00250100)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上原 孝 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (00261321)
西田 基宏 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 教授 (90342641)
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| Project Period (FY) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| Keywords | 環境中親電子物質 / 活性イオウ分子 / エクスポソーム / 複合曝露 / レドックスシグナル変動 / 毒性発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞レベルでの複合曝露実験：8種類の環境中親電子物質の組み合わせを変えて、種々の培養細胞（マウス初代肝細胞、HepG2細胞、A431細胞、SH-SY5Y細胞、A549細胞）を複合曝露し、曝露用量および曝露時間依存的なレドックスシグナル変動および細胞毒性をそれぞれウエスタンブロット分析およびMTT法にて評価した。その結果、1）PTP1B/EGFRシグナルをレドックスシグナル活性化の指標とし、A431細胞において、1,4-ナフトキノン（1,4-NQ）を中心として1,4-ベンゾキノン（1,4-BQ）および1,2-NQを複合曝露する最適条件を確立した。2）Keap1/Nrf2システムをレドックスシグナル活性化の指標とし、HepG2細胞において、(E)-2-アルケナール類を中心として1,2-NQおよび1,4-NQを複合曝露する最適条件を確立した。3）細胞内タンパク質の化学修飾および細胞毒性を指標とし、HepG2細胞において、メチル水銀（MeHg）を中心としてそれ以外の金属類を複合曝露する最適条件を確立した。4）種々の環境中親電子物質と活性イオウ分子との反応による酸化ストレスの惹起を、GSH/GSSGの変動を指標にして検討した。5）蛍光試薬SSP4を用いて、種々の環境中親電子物質によるパースルフィドの消費を簡便に検出できるアッセイを確立した。
MeHgとその代謝物の化学的特性およびRSSとの反応性：MeHgから(MeHg)2Sへの化学合成とその精製法を確立した。(MeHg)2Sの分解で生じる可能性のあるジメチル水銀のGC-MS分析法を確立した。LC/MSおよび FT-ICR/MSによる(MeHg)2Sと活性イオウ分子との反応で生じる生成物の測定条件を検討した。各種有機溶媒によるニンニク中に含まれている活性イオウ分子の抽出条件およびシリカゲルカラムによる粗精製法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒトの生涯における環境曝露の総体としてエクスポソームが注目されている一方で、その研究戦略が問われてきた。我々は先行の基盤研究(S)において、 食生活、生活環境、ライフスタイルを介して摂取される環境中親電子物質の個別曝露実験を行い、低用量ではレドックスシグナルを活性化、高用量では逆に撹乱して毒性を生じること、本現象は高い抗酸化性/求核性を有する活性イオウ分子で制御されることを明らかにした。 そこで本研究では、ヒトの代替として培養細胞およびマウスを用いて、環境中親電子物質に特化したエクスポソームのモデル化および環境中親電子物質のイオウ付加体の生体内運命について検討している。これまでの結果より、1）種々の培養細胞を用いて、環境中親電子物質の複合曝露を行い、細胞内タンパク質の化学修飾量、３種類のレドックスシグナル活性化、細胞毒性を調べるシステムを確立した。予備検討により、環境中親電子物質の複合曝露により、個別曝露に比べて細胞内タンパク質の化学修飾量、レドックスシグナル変動（低用量で活性化、高用量で破綻）および細胞毒性は増加する傾向が観察された。2）非細胞系において、種々の環境中親電子物質と活性イオウ分子との反応による酸化ストレスの惹起を調べたところ、鉛で意外な結果を得た。すなわち、鉛自身はレドックス能がないにも関わらず、パースルフィドが存在するとGSHをGSSGへ化学量論的に酸化することを見出した。本反応はH2Sでは殆ど進行しないことも確認された。このことは、鉛が細胞内で産生される活性イオウ分子の中でパースルフィドと特異的に反応し、過酸化水素のような活性酸素種を産生していることを示唆している。3）メチル水銀のイオウ付加体である(MeHg)2Sを高純度に合成・精製する方法を確立し、次年度以降の非細胞系、細胞系およびマウスでの(MeHg)2Sの生体内運命を調べることが可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞レベルでの複合曝露実験：複合曝露のための被検物質の組み合わせの選別、曝露用量および曝露時間を制御することで、環境中親電子物質エクスポソーム研究のモデル化を試み、先行の基盤 (S)で実施した個別曝露の結果と比較検討する。すなわち、1）培養細胞を大気汚染物質である1,4-NQの異なる用量曝露に加えて、1,2-NQや1,4-BQを一定量曝露してレドックスシグナル変動および細胞毒性の相加効果を調べる。2）食生活のモデルとして、培養細胞をマグロ等の大型食用魚類に蓄積するメチル水銀の異なる用量曝露に加えて、カドミウムや(E)-2-アルケナール類を一定量曝露してレドックスシグナル変動および細胞毒性の相加（相乗）効果を調べる。3）培養細胞をタバコの煙に含まれるクロトンアルデヒドの異なる用量曝露に加えて、1,4-BQを一定量曝露してレドックスシグナル変動および細胞毒性の相加（相乗）効果を調べる。細胞内レドックスシグナル系として、PTP1B/EGFRシグナル、Keap1/Nrf2システム、HSP90/HSF1シグナルおよびPTEN/Aktシグナルの活性化および破綻を解析する。細胞毒性はMTTアッセイで行う。また、市販のRSSあるいはRSSを含むニンニクのヘキサン抽出画分を被検物質と混合して、レドックスシグナル変動および細胞毒性の差異を検討する。
環境中親電子物質のイオウ付加体の生体内運命: 当該物質のモデルとしてメチル水銀（MeHg）を用いる。密閉した容器でMeHgのイオウ付加体である(MeHg)2Sを細胞溶解液と一定時間反応させ、反応生成物をそれぞれHPLC/AASおよびGC/MSで解析する。また、野生型マウスに(MeHg)2Sを投与して呼気を採取可能なケージにて飼育する。採取した呼気をポンプで吸引してXAD-4樹脂に吸着させ、代謝物を有機溶媒で抽出してGC/MSで分析する。
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