2019 Fiscal Year Annual Research Report
Environmental electrophiles exposome and reactive sulfur species as its regulator molecule
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18H05293
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
熊谷 嘉人 筑波大学, 医学医療系, 教授 (00250100)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上原 孝 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (00261321)
西田 基宏 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 教授 (90342641)
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| Project Period (FY) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| Keywords | 環境中親電子物質 / 活性イオウ分子 / エクスポソーム / 複合曝露 / レドックスシグナル変動 / 毒性発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞レベルでの複合曝露実験：HepG2細胞において、(E)-2-ヘキセナールの個別曝露に比べて1,2-NQおよび1,4-NQとの複合曝露により、Keap1のシステイン残基修飾、それに伴う転写因子Nrf2活性化、細胞毒性はそれぞれより低用量で観察された。A431細胞において、1,2-NQの個別曝露に比べて1,4-NQおよび1,4-BQとの複合曝露により、PTP1Bのシステイン残基修飾、それに伴うキナーゼEGFR活性化、細胞毒性はより低用量で観察された。金属の複合曝露において、パースルフィドとの反応性を調べた結果、MeHg、Cd、CuおよびZnはパースルフィドと良好に反応したが、Fe、Sn、AlおよびMgは殆ど反応しなかった。CdやCuとMeHg複合曝露は、MeHg単独曝露に比べ、活性イオウ分子の減少およびMeHgによるアルブミンへのS-水銀化を亢進させたが、Alとの複合曝露はこれらに影響を与えなかった。また、培養細胞をMeHgとCuに複合曝露すると、活性イオウ分子の減少、S-水銀化および細胞毒性の有意な上昇が観察された。マウスにおけるMeHg曝露で見られる協調運動能の低下はパースルフィド処置で阻害されたが、Cdとの複合曝露でその阻害効果は有意に抑制された。
環境中親電子物質のイオウ付加体の生体内運命: (MeHg)2Sの経時的な分解を調べた。有機相および水相に分けて分離した結果、前者からジメチル水銀（DMeHg）、後者から硫化水銀（HgS）がそれぞれ同定された。マウスに(MeHg)2Sを曝露して呼気を採取してGC/MS分析した結果、DMeHgが同定された。一連の結果は、MeHgが生体内の活性イオウ分子で捕獲されて(MeHg)2Sに代謝され、それが徐々に分解されてDMeHgとHgSに変換されることを示唆している。DMeHgは揮発性が高いので、呼気を介して体外に排泄されることが考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒトの生涯における環境曝露の総体としてエクスポソームが注目されている一方で、その研究戦略が問われてきた。我々は先行の基盤研究(S)において、 食生活、生活環境、ライフスタイルを介して摂取される環境中親電子物質の個別曝露実験を行い、低用量ではレドックスシグナルを活性化、高用量では逆に撹乱して毒性を生じること、本現象は高い抗酸化性/求核性を有する活性イオウ分子で制御されることを明らかにした。 そこで本研究では、ヒトの代替として培養細胞およびマウスを用いて、環境中親電子物質に特化したエクスポソームのモデル化を検討してきた。これまでの結果より、培養細胞を用いた結果、環境中親電子物質の複合曝露により、レドックスシグナル系（PTP1B/EGFRシグナル、Keap1/Nrf2経路）のセンサータンパク質の化学修飾および応答分子の活性化は、その個別曝露より低用量で観察されることが明らかとなった。また、複合曝露による細胞毒性も同様であった。一方、環境中親電子物質曝露で観察されるレドックスシグナル変動および細胞毒性は、活性イオウ分子の同時曝露により軽減することも示唆された。
環境中親電子物質は活性イオウ分子により捕獲・不活性化されることから、生じたイオウ付加体の生体内運命を知る必要がある。そこで、メチル水銀（MeHg）をモデルとして、イオウ付加体である(MeHg)2Sの生体内運命についても検討した。各種機器分析での解析の結果、(MeHg)2Sは時間と共に分解して、ジメチル水銀（DMeHg）および硫化水銀（HgS）が生じることが分かった。DMeHgは脂溶性および揮発性が高いことから、マウスを(MeHg)2Sに投与して呼気を採取した。その結果、DMeHgの排泄が確認された。このことはMeHgが生体内で(MeHg)2Sに代謝され、その一部が最終的にDMeHgの形で体外に排泄されることを示唆している。
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| Strategy for Future Research Activity |
採択時の調書に従って研究を推進する。それに加えて、システインパースルフィド（CysSSH）を細胞外に排泄するアンチポーターの同定（下記参照）も並行して行う。
個体レベルでの複合曝露実験： 2019年度に行った細胞レベルでの複合曝露をマウスで実施する。すなわち、マウスに(E)-2-ヘキセナールあるいはメチル水銀（MeHg）を中心として、その他の被検物質を複合曝露して、臓器中レドックスシグナル変動、臓器傷害、協調運動能の低下、致死効果等に加えて、臓器および血漿中システイン（CysSH）、GSHおよびそれらのパースルフィド、硫化水素の濃度変動を検討する。
環境中親電子物質のイオウ付加体の生体内運命：イオウ付加体(MeHg)2SがMeHgSSHおよびその酸化体であるMeHgSSO3H尿中へ排泄される可能性が考えられる。そこで、MeHgSSHおよび MeHgSSO3Hの化学合成を行い、それぞれの標品を用いてMeHg曝露マウスの尿中から同定を試みる。投与尿は活性炭あるいはXAD-4で粗精製を行い、得られた残渣を分取用逆相カラムで単離・精製する。
我々は活性イオウ分子を産生する CSE 遺伝子を全身組織に高発現するトランスシジェニックマウスを解析する際に、偶然にもシステインパースルフィド（CysSSH）を細胞外に排泄するシステムの存在を見出した。この現象はマウス初代肝細胞だけでなく、HepG2 細胞、A431細胞、 HEK293T 細胞、さらには大腸菌でも観察された。その後の検討から、細胞内の CysSSH を細胞外に、かつ細胞外のシスチンの共輸送を司る SLC ファミリーの何れかのアンチポーターであることが示唆された。そこで、当該アンチポーターの同定を試みる。
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