2018 Fiscal Year Annual Research Report
新規受容体キナーゼが制御するトマト単為結果性の制御機構解明
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18J00528
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
嘉祥寺谷 幸子 筑波大学, 生命環境系, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | 単為結果 / 植物 / トマト / 転写因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、トマトにおいて単為結果性を誘導するメカニズムを明らかとすることを目的とした。PFF（SPFF）変異体は受容体様キナーゼに変異を持ち、小さな単為結果果実を誘導する。そこで、この受容体様キナーゼがどの組織で発現するかをRT-PCR法により調べた。2 mmから開花当日までの花芽、葉、茎、根、すべてにおいて発現が見られた。同時に、開花1-2日前に除雄を行い単為結果性を調べた。PFF変異体では1-2週間遅く単為結果が誘導された。これらは、PFF変異によって誘導される単為結果は果実形成初期の応答に起因しないことを示唆している。
次に、果実形成の初期応答に着目し、単為結果性遺伝子のひとつであるPAT-2を用いて研究を行った。PAT-2は転写因子であるZHDファミリー（トマトで22個報告されている）に属している。PAT-2はホモ２量体や他のZHDなどとヘテロ２量体を形成し、下流の遺伝子の転写活性を調節していると考えられているが、その調節機構の詳細は明らかとなっていない。まず、PAT-2の発現時期および発現場所を解析するため、In situ hybridization解析のためのプローブの作成を行っている。また、標的となる遺伝子を調べるため、PAT-2によるChIP-sequenceを予定しており、現在組換え体を作成している。さらに、他のZHDによるPAT-2の制御する単為結果性への影響を調べるため、PAT-2と類似した発現パターンを示す3つのZHDをそれぞれゲノム編集した。現在、これらは解析中であるが、3つのZHDすべて、ゲノム編集された個体が得られており、単為結果性がより強くなった。この結果は、ZHDが互いに相互作用や重複しながら機能し、トマトの着果制御をしていることを示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、主にPAT-2の発現時期・発現部位の解析、ChIPシーケンスによるPAT-2が制御する遺伝子の解析、他のZHDのゲノム編集の３つを主軸としている。
しかし、In situ hybridization解析では、作成したPAT-2のプローブはDIGラベリング効率が低く、センス・アンチセンス鎖でのシグナル強度の差が小さかった。シグナル検出のためにはプローブの改良等が必要である。次に、ChIP-sequence解析では、Native promoter::PAT-2 mRNA_FLAGおよび35S promoter::PAT-2 mRNA_GFP、GFP-PAT-2 mRNAのコンストラクトを作成し、現在形質転換体を作成している。 これらは、未だ結果が得られておらず、今後より研究を進める必要がある。
ゲノム編集トマト作成はPAT-2と類似の発現パターンを示す3つのZHDについて、それぞれコンストラクト作出および形質転換体を作成した。編集された塩基配列の解析は現在実施中であるが、すべての標的遺伝子において欠損等の塩基編集を確認した。また、これらが単為結果を誘導することも確認した。これらより、ゲノム編集個体の解析は順調に進んでいると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. In situ hybridizationでは、現在のプローブを改良し、DIGラベリング効率の良いものを準備する。改良したプローブは様々な時期の花芽を使用して、In situ hybridizationを実施し、花芽組織で発現する部位を明らかにする。
２．ChIP-シーケンス用の形質転換体作成を引き続き行う。同時に、形質転換体作成に用いたベクターを野生型に導入した個体を使用し、ChIP-シーケンス解析の実験条件を検討する。
３．ゲノム編集T0個体の解析を続行する。また、T1もしくはT2世代において、ホモ変異体の作成および単為結果性評価を行い、形質転換に使用したPAT-2の弱いアレルとの比較を行う。
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