2018 Fiscal Year Annual Research Report
加齢性筋機能低下における翻訳速度変化を介した新規作用機序の探求
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18J01099
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
佐古 博皓 東京大学, 工学系研究科, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | 翻訳速度 / タンパク質フォールディング / タンパク質変性 / タンパク質凝集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はマウス骨格筋に対して網羅的な転写・翻訳動態解析を行い，様々なシス配列やトランス因子が翻訳速度に及ぼす影響を解析した結果，miRNAの結合領域の下流と上流におけるリボソームの密度差（≒翻訳速度変化）が，miRNA種によって異なることを見出した．
近年，miRNAとmRNAとの結合パターンは多様性に富み，弱い結合から強い結合まで多様であることが明らかとなってきた．本年度得られた結果も踏まえ，弱くも強くも結合しうるmiRNAの中には，リボソームを完全に阻害するのではなく，一時的に減速させる程度に結合するmiRNAも存在する可能性があると仮定した．
miRNAの翻訳速度への影響を検討するため，CRISPR/Cas9システムを用いてDroshaをノックアウトし，miRNA量が減少している細胞を作成した．また，翻訳速度変化を間接的に検討可能なレポーターを作成するため，凝集する傾向が強いNBD1鎖にEGFPを付加することで可視化した．新生NBD1 は折畳み不全に対して脆弱であり，翻訳速度依存的にmisfoldingや凝集を生ずることが分かっている．そのため，miRNAの有無によって翻訳速度が変化し，新生タンパク質の折りたたみも変化する場合，同レポーターの凝集の有無や相対的な不溶性分画量によって間接的ではあるが，翻訳速度変化を観測することができると考えた．
sgDroshaとNTC，上記レポーターを用いて，miRNA量の変化によるタンパク質の折畳み不全・凝集への影響を評価した．まずは可視化レポーターを用いて，プロテアソーム機能とHSP70を阻害することでsgDroshaにおいてNBD1がより顕著に凝集することを確認した．また，抽出したタンパク質を可溶性分画と不溶性分画とに分離し，プロテアソーム阻害によりsgDroshaで凝集したNBD1が不溶性分画でより蓄積されることを確認した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の計画は，マウス骨格筋における転写・翻訳動態を網羅的に解析し，翻訳速度に変化が認められるか否かを検討し，翻訳速度変化の原因因子候補のスクリーニングに焦点を置いていた．
本年度の結果として，網羅的データを解析し翻訳速度に影響を与えている可能性のある因子を見出し，miRNAが翻訳速度と新生タンパク質の折畳みに寄与しているとの仮説を立てた．さらに，細胞を用いてタンパク質の変性・凝集を検討可能なレポーターも作成し，グローバルなmiRNAの減少とプロテアソーム阻害に伴うレポータータンパク質の凝集を確認することもできた．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はまず，本年度得られたレポータータンパク質の凝集が新生タンパク質由来であることを確認するため，可逆的な翻訳阻害剤であるシクロヘキサミドを用いて，新生タンパク質の合成を阻害し，レポーターの凝集をレスキューすることができるか検討する．その際，翻訳速度の低下の模倣として新生タンパク質産生量を低下させない低濃度のシクロヘキサミドを用いて翻訳速度を低下させることでも凝集をレスキューすることが可能か検証する．
また，グローバルにmiRNAを減少させているため様々な交絡因子の存在が考えられる．考えられる交絡因子を排除するために，miRNAに結合すると考えられるNBD1配列の変異体と特定のmiRNAを強発現することで，これまでの結果を再現可能か検討する．
同時に，翻訳速度変化を恣意的に変化させることでタンパク質の変性凝集を軽減するこが可能かも検討する．CRISPR/dCas9を用いて，細胞質内の標的mRNAに特異的に結合しリボソームによる翻訳を阻害することなく一時的に翻訳速度を遅らせることが可能なシステムの構築を目指す．
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