加齢性筋機能低下における翻訳速度変化を介した新規作用機序の探求

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18J01099
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 佐古 博皓 東京大学, 工学系研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2018-04-25 – 2021-03-31
• Keywords: 翻訳速度

Outline of Annual Research Achievements

前年度までに得られた結果が他のmiRNA生成酵素（Ago2）のノックアウトによっても再現できるか検証した。上記タンパク質変性レポーターを用いて、miRNA量の変化によるタンパク質の折畳み不全・凝集への影響を評価した。まずは可視化レポーターを用いて、プロテアソーム機能を阻害することでAgo2ノックアウト細胞においてレポーターがより顕著に凝集することを確認した。さらに、凝集したレポータータンパク量を比較するために、可溶性分画と不溶性分画とに分離し、プロテアソーム阻害によりAgo2ノックアウト細胞においてで凝集したレポーターが不溶性分画でより蓄積されることを確認した。
さらに、レポーターmRNAへのmiRNAの結合とタンパク質変性との因果関係を検討するために、①レポーター配列に変異を導入することでmiRNAの結合を阻害する方法と、②miRNAの結合を分散させることでmiRNAとレポーターmRNAとの結合を阻害する方法を試みた。①に関して、どのmiRNAがレポーターmRNAのどの位置に結合するのかを予測するために、Ago-CLIPのデータなどをベースに開発されたTarPmiRアルゴリズムを用いて、レポーターmRNAのどの位置にどのmiRNAが結合するのかを予測し、結合配列を同義コドン置換した。しかしその際、mRNAの高次構造やコドン最適度への影響を最小限に抑える必要があったため、同義コドン置換が可能な配列は限定的であった。そのため、変異レポーターによるmiRNAの結合阻害は局所的であった。効率的にmiRNAとレポーターmRNAとの結合を阻害する方法として、miRNAの結合を分散させる手法を用いた。同手法により、miRNAのレポーターmRNAへの結合が減少することにより、レポータータンパク質がより変性しやすく、凝集したレポーターが不溶性分画でより蓄積されることを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

miRNAによるレポータータンパク質変性の抑制効果を検討するために、レポーター配列に変異を導入することでmiRNAの結合を阻害する方法と、miRNAの結合を分散させることでレポーター配列へのmiRNAの結合を阻害する方法を試みた。変異導入による方法にいては、レポーター配列を同義コドン置換する際に、RNA高次構造やハイブリダイゼーションエネルギーの変化を最小限に留める必要があるため、miRNAの結合を阻害するほどの変異の導入は難しく、miRNAを利用した実験では、顕著にmiRNAの結合を阻害でき、miRNAがレポータータンパク質の変性を制御していることを支持する結果を得ることができた。

Strategy for Future Research Activity

今後は、具体的にどのような作用機序によってmiRNAがレポータータンパク質の変性を抑制しているのかを検討する。まず、翻訳速度の遅れを定量化するために、リボソームプロファイリングによって、レポーター上において局所的な遅れが生じているのか検討する。また、翻訳速度の遅れがタンパク質の折畳みを促進する機序として、HSPシャペロンのより効率的な誘導が考えられるため、共免疫沈降により翻訳速度の遅れによりレポーターmRNAがより濃縮されるのか検討する。
また、レポータータンパク質以外の内在性タンパク質でも同様の現象が生ずるのかも検討し一般化する。具体的には、レポータータンパク質をコントロールとして用いてLC/MS/MSを利用し、不溶性分画においてより顕著に存在する内在性タンパク質を探索する。