2019 Fiscal Year Annual Research Report
透過型電子顕微鏡を用いた１分子トラッキングによるタンパク質の結晶化過程の解明
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18J01470
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
山崎 智也 北海道大学, 低温科学研究所, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | タンパク質結晶 / 結晶化 / “その場”観察 / 透過型電子顕微鏡 / 溶液セル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題の実験的な目標の一つは、フェリチンタンパク質が結晶化する瞬間を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で“その場”観察することである。昨年度、ＴＥＭを用いた液中“その場”観察を行う際の結晶化条件を決めるために予備実験を行ったところ、フェリチン結晶の核生成頻度は非常に低いことが分かった。ＴＥＭでの観察に用いる溶液セルの体積は非常に小さく、また、ＴＥＭで観察可能な範囲も非常に狭い。これらのことから、フェリチンが結晶化する瞬間をＴＥＭで捉えることは非常に困難である。そこで如何にして観察視野で結晶化を促進させるかの検討を行った。
昨年度の時点で検討を進めていた事項（不均質核生成を促進する基板の導入、及び、溶解度を低下させる貧溶媒の添加）に対し、より溶液セル内の結晶化条件を能動的に制御できる有力な手法として、電極を溶液セルに導入し、結晶化を促進させる手法を考案した。これは導入した電極に交流電場を印加し、電場勾配を作ることによってタンパク質分子に誘電泳動力を働かせる。その力を利用して電極周囲にタンパク質分子を集合させ、局所的にタンパク質濃度が高い領域をつくることで結晶化を導くという手法である。まず、この手法を取得するため、電極を配置した溶液セルを自作した。これにコロイド溶液（ポリスチレン、金など）を入れ、ファンクションジェネレータを用い電極に交流電場を印加して光学顕微鏡で“その場”観察した。誘電泳動力は、印加する電圧とその周波数に依存するため、最適な周波数条件を導き、粒子が電極周囲に集まることを確かめた。また、電極を搭載した溶液セルをＴＥＭに導入し、金コロイドの誘電泳動に対する応答性を“その場”観察した。その結果、本手法が溶液セルを用いたＴＥＭでの“その場”観察に応用が可能であることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
溶液からの結晶化をＴＥＭで“その場”観察するためには、溶液セル内において、如何にして観察している箇所の溶液条件を制御するかが重要である。そのため、“その場”観察しているときに溶液を結晶化する条件に変化させることが最も効率が良い。従来は、これを“その場”観察中に行える手法がなかったために、結晶化する瞬間を捉えることは非常に困難であった。そのため、結晶核をいかに生成させるかという手法の検討を行い、溶液セルに電極を導入する手法を考案した。本手法は電極周囲の溶液条件を能動的に制御できる可能性があり、この問題の根本的な解決が期待できる。
フェリチンタンパク質の結晶化を捉えることは難航しているが、その根本的な解決策を考案できたことは当初の計画以上の発展である。以上よりおおむね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
誘電泳動は電極間に交流電場を印加し電場勾配を作ることによって溶液中の粒子が泳動する現象であるが、このときに粒子がうける誘電泳動力は粒子のサイズ、電場勾配、交流の周波数、粒子および媒質の誘電率などに依存する。本現象をタンパク質の結晶化に応用するために、電極を搭載した既存のシリコンチップを用いて溶液セルを作製し、高分解能光学顕微鏡、及び、透過型電子顕微鏡を用いたタンパク質結晶化の“その場”観察を実施する。誘電泳動力は、その力がかかる粒子のサイズが大きいほうがより強くなる。また、印加する交流電圧の周波数により、電極周囲の粒子の応答性（電極に引き寄せられるか、引き離される）が変化する。このような条件を“その場”観察しながら見極め、結晶化実験のための条件を整える。このようにしてタンパク質が結晶化する瞬間を捉え、タンパク質結晶化の描像解明へのアプローチを行う。
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