2018 Fiscal Year Annual Research Report
In vitro卵作出系を応用した新規手法によるインプリント機構の解明
| Project/Area Number |
18J01481
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
|---|
Principal Investigator |
佐々木 恵亮 東京農業大学, 生命科学部, 特別研究員(PD)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
|
| Keywords | レンチウイルス / 卵 / 卵巣培養 / RNAi / ゲノム編集 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
平成30年度はin vitroおよびin vivoからのアプローチ双方について研究を進めた。
In vitroからのアプローチ：新生仔マウスの卵巣より非成長期卵母細胞を分取し、レンチウイルスベクターを用いて外来遺伝子を高効率に導入できることが可能となった。また、非成長期卵母細胞と卵巣体細胞を凝集させた再構築卵巣の作出および再構築卵巣の器官培養系を構築することができた。現在は、レンチウイルスベクター感染時間、感染量や、卵巣再構築条件の検討を行い、遺伝子導入卵母細胞がより効率的に生存できる培養系の構築に取り組んでいる。また、microRNAによる内在性遺伝子発現制御機構を利用し、人工的に設計したartificial microRNA (amiRNA)を用いたin vitroノックダウンシステムを構築した。amiRNAをマウスES細胞に強制発現させることで、標的遺伝子の発現量を20%以下にまで抑制できた。これによってシングルコンストラクトで複数の遺伝子を同時に抑制できるスクリーニングが可能となる。
In vivoからのアプローチ： ゲノム編集技術を応用して「卵母細胞特異的RNAiマウス」を作出することに成功した。GFPトランスジェニック受精卵のZp3遺伝子座に、CRISPR/Cas9によってGFPを標的とするamiRNAをノックインし産仔を得た。Zp3は成長期に入った卵母細胞のみで発現するため、amiRNAは卵母細胞特異的に発現すると考えられた。実際に、得られた産仔のGFP蛍光強度は卵母細胞特異的に減衰することが確認され、amiRNAによるRNAi作用が卵母細胞特異的であることが証明された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
In vitroからのアプローチでは、レンチウイルスベクターを感染させた卵母細胞を含む再構築卵巣の培養条件を模索している段階だが、スクリーニングに使用するシングルコンストラクトでの複数遺伝子の同時ノックダウンは技術的基盤を整えることができた。一方で、in vivoからのアプローチでは、すでに卵母細胞特異的RNAiマウスを作出することが出来ており、期待以上の成果をあげることができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本年度以降は、平成30年度でとくに大きく進展したin vivoからのアプローチに力を入れて取り組む予定である。現在までに、上記のような進展が得られた一方で、ゲノム編集によるノックインの効率、ノックインの正確性およびモザイシズムという課題が新たに浮上した。ノックイン効率および正確性については、ゲノム編集時に用いるCas9タンパク質、guide RNAおよび一本鎖DNAの濃度や含有割合を検討する必要がある。さらに、一本鎖DNAに含まれるホモロジーアーム長をより長くすることで、より正確なノックインを誘導できると思われる。また、モザイシズムに対する方策としては、当初の研究計画ではF0世代の遺伝子改変マウスにおいて遺伝子機能を解析する予定であったが、今後はF0雄個体をC57BL/6N系統雌マウスと交配させたF1世代以降のマウスを用いて解析を進めることとした。現在は、この卵母細胞特異的RNAiマウスシステムが内在性遺伝子を標的とした場合も有効であることを証明するため、機能既知の遺伝子を標的とする遺伝子改変マウスの作出にとりかかっている。
また、in vitroからのアプローチで構築したin vitroノックダウン系を応用して、よりオフターゲットの少ないamiRNAを選別し、一度に複数遺伝子を標的とできるシステムを作り上げる。オフターゲットの予測はBLASTおよびmiRDBを用いて行うとともに、定量RT-PCRで実際に起こるオフターゲット効果を検証する。
|
