2019 Fiscal Year Annual Research Report
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ卵作出系を応用した新規手法によるインプリント機構の解明
| Project/Area Number |
18J01481
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
|---|
Principal Investigator |
佐々木 恵亮 東京農業大学, 生命科学部, 特別研究員(PD)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
|
| Keywords | 卵母細胞 / ゲノムインプリンティング / ゲノム編集 / RNAi / microRNA |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではマウス卵形成過程におけるゲノムインプリンティングの確立機構を理解するため、エピジェネティック関連遺伝子を卵母細胞特異的に発現抑制する遺伝子改変システムを構築する。卵母細胞特異的に発現する遺伝子のイントロンに人工的に配列を設計したマイクロRNA様配列(amiRNA)をノックインすることで、卵母細胞特異的なRNAi効果が得られることを平成30年度までに明らかにした。その中でゲノム編集によるamiRNA配列のノックインの効率、正確性およびモザイシズムといった課題が挙がっていた。令和元年度はまずこれらの問題点の解決にとりかかった。ノックイン効率はエレクトロポレーション時のCas9タンパク質の濃度等の変更により、ノックインの正確性はホモロジーアームの塩基長の伸長によりそれぞれ克服でき、内在性遺伝子を標的とする卵母細胞特異的RNAiマウスを作出することに成功した。また、ファウンダーマウスのモザイシズムについてはこれ以上の改善が難しいと考え、ファウンダーを交配させて作出したF1世代以降の動物を用いた解析を行うこととした。
作出した卵母細胞特異的RNAiマウスを用いた解析により、卵母細胞特異的なノックダウンが成長期に進入した卵母細胞でのみ生じること、成長を完了したGV期卵においてはほぼ完全なサイレンシングが起きることがわかった。以上のことは、本システムが成長期以降のマウス卵母細胞における新たな遺伝子機能解析ツールとして有効である裏付けとなった。
さらに、培養細胞を用いた解析によって、複数の遺伝子を同時に標的とするノックダウンが可能になった。現在は、内在性遺伝子を標的とした卵母細胞特異的RNAiマウスを複数系統樹立し、その解析を進めている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要に記載したように、前年度の課題点はほぼ解決することができた。また、標的遺伝子以外の遺伝子の発現抑制をしてしまうオフターゲットを低減したamiRNAシステムの検証を予定よりも早く完了でき、異なる2種類の基底部配列を持つamiRNAをノックインした卵母細胞特異的RNAiマウスを作出することができた。このことから、本システムによるノックダウン効果およびオフターゲット効果を今後より詳細に解析することができると考えられる。
さらに、卵形成過程で起こるゲノムインプリンティングの確立に関与する可能性のある遺伝子群を標的とするamiRNA配列を絞り込み、培養細胞レベルでその機能を検証し終えているため、令和2年度以降の研究に円滑に移行することができる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
卵母細胞で発現する機能既知の遺伝子をノックダウンの標的とした卵母細胞特異的RNAiマウスをすでに2系統作出済みである。これらのRNAiマウスは、miRNAの基底部の配列が異なっており、これによってノックダウン効果やオフターゲット効果に差が生じると推察される。令和2年度では、トランスクリプトーム解析等によって基底部配列の違いがもたらす機能差について比較検証する予定である。さらに、令和元年度に構築したポリシストロニックなノックダウン法を用いることで、複数のヒストン修飾遺伝子を同時にノックダウンした多重RNAiマウスの作製を行い、これらの遺伝子が果たす母性インプリント確立への影響を検証する。
|
Research Products
(2 results)
