新規大腸癌幹細胞特異的表面マーカーを標的とした抗体治療の開発

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18J01600
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 後藤 規弘 滋賀医科大学, 薬理学講座, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2018-04-25 – 2021-03-31
• Keywords: IL17RB

Outline of Annual Research Achievements

DCLK1はマウス腸腫瘍幹細胞に特異的に発現するマーカーであるが、ヒト大腸癌における役割は十分に解明されていなかった。申請者はマウス、ヒトの双方でDCLK1陽性細胞に特異的に発現する細胞表面マーカーとしてIL17RBを同定した。ヒト大腸癌オルガノイドに対して、CRISPR-Cas9でIL17RBの終止コドン直前に2A-CreERT2をノックインしてlineage tracingを行うと、IL17RB陽性細胞は子孫細胞供給能と自己複製能を持つことがわかり、IL17RBはヒト大腸癌においても癌幹細胞をマークすることが示された。さらに、IL17RB陽性細胞を標的とした治療の効果を評価するために、CMV-loxp-DsRed-loxp-iCaspase9-2A-EGFPベクターを作成し、レンチウイルスを用いて前述のIL17RB-2A-CreERT2をノックインした大腸癌オルガノイドに導入した。このコンストラクトを用いることで、タモキシフェンとDimerizerを投与してIL17RB陽性細胞を特異的にアブレーションすることが可能になった。この遺伝子改変後のオルガノイドを免疫不全マウスの皮下に移植し、腫瘍が形成されたのちにIL17RB陽性細胞のアブレーションを行った。すると、長期的なアブレーションにより強力な腫瘍増殖抑制効果が認められた。また、アブレーション後の遺残した腫瘍を組織学的に評価すると、癌の腺管構造の破綻や、細胞構造の変化を認めた。しかし、siRNAを用いてIL17RBをノックダウンしても、オルガノイド増殖能に変化はみられなかった。これらの結果より、IL17RBは癌幹細胞をマークしているが、機能的には細胞増殖や細胞維持に関与しないことがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ゲノム編集を行った大腸癌オルガノイドを樹立し、lineage tracing実験を行うことで、IL17RB陽性細胞はヒト大腸癌幹細胞をマークすることが示された。さらに、IL17RB陽性細胞のablation実験を行うことで、この細胞を標的とすれば大腸癌の増殖抑制効果が得られることがわかった。また、IL17RBノックダウン実験を行うことで、IL17RBの機能自体は癌細胞増殖に関与していないこともわかった。これらの結果から、IL17RB陽性細胞を標的とした新規大腸癌治療開発に必要な基礎的なデータが得られたと思われ、おおむね順調に進展したと思われる。

Strategy for Future Research Activity

前年度までの研究で、IL17RBは大腸癌幹細胞をマークするが、機能的には細胞増殖や細胞維持に関与しないことがわかった。これらの結果から、IL17RB陽性癌幹細胞を標的とする大腸癌治療法としては、IL17RBの中和抗体や阻害薬を用いるストラテジーではなく、IL17RB陽性細胞のアブレーションを可能とするような、殺細胞薬をFc領域に結合させたキラー抗体の作成が必要である可能性が示唆された。今後は、IL17RB陽性細胞を標的とした新たな大腸癌幹細胞治療法の開発を目標として、上記の抗体治療の可能性を検証していく。具体的には、IL17RBの細胞外ドメインのリコンビナントタンパクを作製し、これを免疫したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞を融合させたハイブリドーマを作製してクローン化する。抗原に親和性の高いクローンを選別し、得られた複数のハイブリドーマ・クローンから、モノクローナル抗体を作製する。その後、モノクローナル抗体のFc領域に殺細胞薬を結合させ、キラー抗体を作製する。このキラー抗体をヒト大腸癌xenograftモデルに投与し、腫瘍縮小効果の有無を評価する。

Research Products

• [Journal Article] Lineage tracing and targeting of IL17RB(+) tuft cell-like human colorectal cancer stem cells (2019)
  • Author(s): Goto N, Fukuda A, Yamaga Y, Yoshikawa T, Maruno T, Maekawa H, Inamoto S, Kawada K, Sakai Y, Miyoshi H, Taketo MM, Chiba T, Seno H.
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci U S A Volume: 116 Pages: 12996-13005
  • DOI: 10.1073/pnas.1900251116
  • Peer Reviewed / Open Access