2018 Fiscal Year Annual Research Report
On-site virus and bacteria diagnostics using bioluminescent DNA sensor
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18J01772
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
鈴木 和志 東京大学, 総合文化研究科, 特別研究員(SPD)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | 生物発光 / ゲノム編集 / CRISPR / BRET / DNA / ウィルス / POCT |
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| Outline of Annual Research Achievements |
任意配列DNAを高感度検出する技術は、「その場」での疾病診断、DNA鑑定、ウィルスDNA 診断が可能になると考えられるため、非常に魅力的なターゲットである。本研究では生物発光技術とゲノム編集技術CRISPR-Cas9を組み合わせることで、任意配列DNAに対する生物発光センサーの開発を行う。
まず、標的DNA認識に伴うCas9タンパク質の構造変化を生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）効率の変化として検出することを試みた。BRETはルシフェラーゼの発光エネルギーで近傍の蛍光色素が励起される現象であり、その効率がルシフェラーゼと蛍光色素の距離によって変化することから、Cas9タンパク質の構造変化を発光波長変化として読み出すことができる。しかしながら、大腸菌を用いた発現系ではCas9-NanoLuc融合タンパク質を調整することが困難であることがわかった。そこで、新たな検出原理としてCas類縁体の持つ特異なヌクレアーゼ活性に着目し、標的DNAを生物発光で高感度検出するためのレポーター分子を設計した。合成したレポーター分子はCas類縁体の標的DNA認識に伴って、生物発光強度が約５倍変化することがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題は、任意配列DNAに対する生物発光センサーを開発し、病原菌由来DNAを高感度検出する事を目的とする。当初の計画通り、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）とCas9タンパク質の構造変化に基づくセンサー構築を試みたが、大腸菌を用いたタンパク質調整が困難であることがわかった。そこでで、Cas類縁体の持つ特異なヌクレアーゼ活性に着目し、生物発光レポーター開発に成功した。申請書から修正を強いられたが、任意DNAを標的にできる汎用性は失われることはなく、さらに感度においてはこれまでの物を上回ると予想される。その一方で、本レポーターを用いてどれだけ類似したDNAを見分けることができるかは今後検討していかなければならない。成果としては、2年目に行う予定であった高感度化に繋がる新たなレポーター開発に成功したが、より詳細な性能評価が必要とされるため、総合的に”おおむね順調に進展している”と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、レポーター分子とCas類縁体を組み合わせて、相同性の高いDNA配列を見分けて検出することができるかを検証する。また、微量DNA検出のためにはレポーター分子由来のバックグランドを抑える必要がある。その課題に対しては、レポーター分子の精製および最適化を行っていく予定である。
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[Journal Article] Rational conversion of chromophore selectivity of cyanobacteriochromes to accept mammalian intrinsic biliverdin2019
Author(s)
Keiji Fushimi, Takatsugu Miyazaki, Yuto Kuwasaki, Takahiro Nakajima, Tatsuro Yamamoto, Kazushi Suzuki, Yoshibumi Ueda, Keita Miyake, Yuka Takeda, Jae-Hoon Choi, Hirokazu Kawagishi, Enoch Y. Park, Masahiko Ikeuchi, Moritoshi Sato, Rei Narikawa
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Journal Title
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Book] 再生医療2018
Author(s)
鈴木和志、稲垣成矩、松田知己、永井健治
Total Pages
2018年5月号148-153ページ
Publisher
日本再生医療学会
ISBN
978-4-7792-2082-1
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