2018 Fiscal Year Annual Research Report
超微量タンパク質絶対定量法によるがん関連シグナル伝達系の包括的プロファイリング
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18J01791
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
益田 恵子 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | 無細胞タンパク質合成 / 質量分析 / 絶対定量 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の無細胞タンパク質合成法と質量分析を用いた絶対定量法では、下記①の構造の安定同位体標識ペプチドと、安定同位体標識されていない濃度既知の定量用タグを用い、下記②の計算式を用いて試料中のターゲットペプチドを定量する。
①MDYKDDDDKLLLLK（精製用タグ）－ LVTDLTK（定量用タグ）－ XXXXX（ターゲットペプチド）
②LVTDLTK添加量×定量用タグ比（標識/非標識）×ターゲットペプチド比（非標識/標識）
オリジナルの定量用タグLVTDLTKを基に、LVXXLTKを新規定量タグの候補として設計した。置換するアミノ酸には、トリプシン消化を受けるもの、酸化や脱アミド化などの修飾を受けるもの、質量分析における検出強度が低い傾向があるもの等を除いた11種類を用いた。121種類のLVXXLTKとそれらのリジン13C6安定同位体標識ペプチドを質量電荷比（m/z）順に並べ、前駆体イオンの識別が困難にならないように、43種類まで選別した。それらをFmoc固相合成法により合成し、溶解性の低かった8種類を除外し、最終的に35種類を選別した。そして、化学合成ペプチドの濃度をアミノ基定量法により精密定量し、定量スタンダードミックスを調製した。また、各々をコードするプラスミドを作製した。構築した35種類の多重定量法の評価は、市販の質量分析用スタンダード（6タンパク質のトリプシン消化物）を用いて行った。選別したターゲットペプチドをコードする上記①の鋳型DNAをPCR法により調製し、それら35種類を混合し、同一反応系で無細胞合成法により合成することができた。それをトリプシンで消化し、質量分析用スタンダードと定量スタンダードミックスを混合し、nanoLCとオービトラップ質量分析計を用いて解析し、正しく定量できることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
無細胞タンパク質合成法と質量分析を用いた絶対定量法は、安定同位体標識内部標準ペプチドの調製量をフェムトモルオーダーに抑えた極めて安価で簡便な定量法である。しかしながら、LVTDLTKという特定の配列の定量用タグを用いるという原理のため、多重解析を行うことができなかった。そこで本年度は定量法の改良に取り組み、新たに34種類の定量用タグを構築し、それらをコードするプラスミドと、濃度既知のスタンダードペプチドミックスを調製した。定量用タグを多様化したことにより、一度の分析で35種類のペプチドをfmolオーダーで定量可能な系を確立した。さらに、改良した定量法を用いて、共同研究も含め、リボソーム再構成メカニズム解析、膜受容体の発現及び機能解析、大規模がんマーカースクリーニングなどが進捗しており、期待以上の研究の進展があった。リボソーム再構成メカニズム解析に関しては、リボソーム30Sサブユニットを構成する21種類のタンパク質の構成比及びその変動を定量解析することができ、その再構成メカニズムの解明に繋がる知見を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
定量用タグを多様化したことにより、一度の分析で35種類の非翻訳後修飾ペプチドを定量可能な系を確立した。今後は、リン酸化などの翻訳後修飾ペプチドを定量可能な系の確立を試みる。その後、改良した定量法を用いて、シグナル伝達因子の包括的プロファイリングの構築に取り組む。キナーゼや転写因子等の定量ターゲットペプチドを選別し、構築した定量用タグと組み合わせた安定同位体標識ペプチドを無細胞合成法により合成する。そして、HEK293T（ヒト小児腎臓細胞）やCHO（チャイニーズハムスター卵巣細胞）などの非がん細胞株や、HeLa（ヒト子宮頸がん）、MCF-7（ヒト乳がん）、HepG2（ヒト肝がん）などのがん細胞株を用いて、各因子の発現量、細胞内分布、リン酸化状態を質量分析により定量解析する。
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