2018 Fiscal Year Annual Research Report
生殖細胞様細胞株を用いたpiRNA生合成機構の解明
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18J11121
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
住吉 哲太朗 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2020-03-31
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| Keywords | piRNA / l(3)met / ping-pong機構 / vasa / nuage / RNA-binding / iCLIP / 生殖細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
piRNAは生殖組織特異的な小分子RNAであり、トランスポゾンの抑制に寄与することで、生殖組織の健全な発生に貢献している。体内で生合成されるpiRNAの生成機構は複数種類報告があるが、なかでもping-pong機構は生殖組織のうち生殖細胞のみで生じているため、解析に十分量の細胞を集めることが技術的に難しく、解析が困難であった。そこで、本研究ではゲノムや遺伝子情報の蓄積があり、かつこれまでpiRNA生合成機構の解析に頻繁に使用されてきたショウジョウバエ由来である細胞株delta-mbt-OSC株の樹立を行い、成功した。また、ping-pong機構に必須であるヘリカーゼタンパク質、Vasaはping-pong機構が生じているnuageの足場の形成に関わっているが、どのようなメカニズムでVasaがnuageを形成しているかは不明であった。そこで、本研究では、delta-mbt-OSCを用いて、Vasaがnuage様の顆粒を形成する過程の解析を行った。
Vasaの欠損変異体や点変異体を作製して発現させたところ、RNA結合部位に欠損や変異が入り、RNAと結合することができない変異体では、nuage様の顆粒の形成ができなかった。この結果から、Vasaのnuage様顆粒の形成には、RNAに結合できることが必要であると考えられる。しかし、RNAに結合できるVasaをS2細胞株に発現させてもnuage形成が起きないことから、Vasaがnuageを形成するにはRNAに結合する以外の他の要素も必要であることが考えられる。現在はその要素の解析を続けている。また、Vasaに結合するRNA をiCLIP法によりRNAを回収し、次世代シーケンサーを用いて解析したところ、ping-pong機構においてAubが切断したRNAをはがすVasaが、決まった位置に結合することがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、生殖細胞様細胞株であるdelta-mbt-OSCを用いて、生殖細胞にて生じるpiRNA生合成機構の解明を目指している。生殖細胞では、核膜近傍に存在する顆粒であるnuageでpiRNA生合成が生じると考えられており、そのコアとなるタンパク質はVasaであると考えられているが、Vasaが核膜近傍に局在して顆粒を形成し、相互作用因子と共にnugaeを作る一連の機構の詳細は未解明である。本研究では、Vasaの欠損変異体や、点変異体を用いた局在解析により、Vasaの核膜近傍への局在や、顆粒形成にはRNA結合能が必要であることを順当に示すことができた。しかし、生殖系列ではない細胞株であるS2でVasaを発現させた場合、Vasa はRNAに結合するにも関わらず、核膜近傍への局在や、顆粒形成を形成示さなかった。この結果より、RNA結合能がVasa局在の必要十分条件ではないと考えられた。そこで現在、Vasaを局在すさせる要因を調べるために、共免疫沈降法を用いて、Vasaに結合する相互作用因子の解析を順調に進めている。尚、結合するRNAについては、当初の予定にはなかったが、VasaのRNA結合位置について、ping-pong機構に関与するPIWIタンパク質であるAubとAGO3によって制御されていることを新たに見るけることができた。よって、総合して当研究は順調に進んでいると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの実験により、Vasaに結合するタンパク質やRNAの回収に成功している。まず、これら回収された因子が、どのような因子であるか、詳細な解析を進める。そして、特定された因子について、Vasaの局在に実際に必要であるかを、発現抑制等を行って調べる。これらの実験により、Vasaが核膜近傍に局在する要因について調べてまとめる。その解析結果が、まとまった後には、Vasaよりもnuage局在ヒエラルキーの低いAubなどの因子が、局在するのに必要な要素を調べたいと考えている。nuageは、Phase separationを起こしているとも考えられる。Phase separationや、nuageを構成する因子の先行研究を参考にしつつ、nuageの解析をdelta-mbt-OSCを用いて進めていきたい。また、本研究のこれまでの解析により、思わず、VasaのRNA結合位置は、ping-pong機構に関与するPIWIタンパク質であるAubとAGO3によって制御されている可能性を新たに見るけることができた。これについても、当初の予定にはなかったが、解析を進めていきたいと考えている。そして、これらの解析により、生殖細胞におけるpiRNA生合成機構の理解を進めたい。
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