タンパク質工学とゼブラフィッシュ受精卵を利用したアデニン置換技術の開発

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18J14073
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 田中 愼吾 京都大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2018-04-25 – 2020-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / Target-AID / ゼブラフィッシュ

Outline of Annual Research Achievements

本年度はDNA上の特定のシチジンを脱アミノ化するゲノム編集手法（Target-AID法）のゼブラフィッシュにおける効果検証を行い、その結果をまとめた論文がScientific Reports誌に掲載された。
加えて、Target-AID法を改変することにより、アデニン置換技術の新規開発を行った。具体的には、DNA上のシチジンを脱アミノ化するシチジンデアミナーゼ（AID）の活性部位を、RNA上のアデノシンを脱アミノ化するアデノシンデアミナーゼ（ADAR）の活性部位と置換した。この人工酵素をコードするmRNAを、標的DNAを規定するguide RNAと共にゼブラフィッシュ受精卵に導入した。導入した受精卵のゲノムDNAに由来するクローンをシーケンス解析した結果、guide RNAが規定する配列上のアデニンがグアニンに置換されたクローンが数%の頻度で確認された。
一方で、DNA上の特定の4塩基のみを置換するというTarget-AIDシステムのDNA編集における特異性を利用し、DNA二本鎖切断を生じずに予測可能な欠失変異を生じさせる新規ゲノム編集手法の開発にも着手した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

数種類の改変型Target-AIDの作製とその効果検証を行った。その結果、低頻度ながらguide RNAが規定する標的配列上のアデニンをグアニンに置換する活性を有した改変型Target-AIDを選抜することに成功した。一方で、当研究を進める中で新たに着想した新規ゲノム編集技術の開発にも着手した。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、上記の新規ゲノム編集技術の改良を行う。アデニン置換技術に関してはハーバード大が類似した技術であるadenosine base editor (ABE)を発表したため、予測可能な欠失変異を導入する新規ゲノム編集技術の開発を主に進める方針である。変異の純度を高めるために、使用する酵素の最適化を行う。その後、複数箇所の同時編集効率やoff-target効果の検証を行う。

Research Products

• [Journal Article] In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. (2018)
  • Author(s): Tanaka, S., Yoshioka, S., Nishida, K., Hosokawa, H., Kakizuka, A., and Maegawa, S.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 8 Pages: 11423
  • DOI: 10.1038/s41598-018-29794-9
  • Peer Reviewed / Open Access