2018 Fiscal Year Annual Research Report
セルラーゼ糖質結合モジュールとリグニン間相互作用の高分解能NMRによる解明
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18J20331
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
徳永 有希 京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | 糖質結合モジュール / リグニン / NMR / セルラーゼ / 相互作用解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リグノセルロース資源の酵素糖化ではセルラーゼがリグニンに吸着するため、糖化効率が著しく阻害される。特にセルラーゼ糖質結合モジュール(CBM)が吸着に大きく影響するため、リグニン-CBM間相互作用メカニズムの解明が酵素糖化を効率化する鍵となる。本研究ではリグニン-CBM間の相互作用を明らかにすることを目的としてNMRによる相互作用解析を行っている。これまで、セルラーゼ生産菌として主要な糸状菌Trichoderma reesei由来Cel7AのCBM1を15N-ラベル体として発現、精製し、セロヘキサオースおよびスギ、ユーカリリグニンを用いた滴定実験を、二次元NMRを用いて行った。その結果、セロヘキサオースおよびリグニンは、TrCBM1が有する3つの疎水性アミノ酸由来の平滑面と顕著に相互作用することを見出した。また、セロヘキサオースは平滑面とクレフトにおいて特異的にTrCBM1と相互作用するが、リグニンは平滑面とクレフトを含めた複数の部位でTrCBM1と相互作用していることが明らかとなった、以上の研究内容をまとめ論文発表した（Scientific Reports, 2019）。
また、リグニン側の相互作用部位を明らかにする目的で13C-ラベルしたβ-O-4結合型リグニンオリゴマーモデルの有機合成を行った。リグニンオリゴマーモデルを二次元NMRで観測後にTrCBM1を加え、NMRシグナルの変化から相互作用部位を評価した。その結果、リグニンオリゴマーモデルの芳香環炭素のみが顕著にTrCBM1と相互作用していることが明らかとなった。また、明確な相互作用は重合度が4-5以上のリグニンオリゴマーモデルに限って観察され、TrCBM1との相互作用にリグニンの分子量が関与することを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画調書において、平成30年度では(課題1)TrCBM1のリグニンとの相互作用部位を詳細に明らかにすること、(課題2)二次元NMRによりリグニン側の相互作用部位を明らかにすることの2つの課題を記載している。課題１について、相互作用部位のアミノ酸変異体の調製は行っていないものの、セロヘキサオースとリグニンの相互作用を比較し、その特徴を明かにするとともに、論文発表を行った。また、課題2については13C-ラベル化β-O-4結合型リグニンオリゴマーモデルを有機合成し、TrCBM1との相互作用を二次元NMRで詳細に解析することができている。以上より、課題1、2をおおむね満足し、TrCBM1側とリグニン側の双方から詳細な相互作用部位の解析に成功しているため、おおむね順調に進展していると判断した
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画調書に従い、(課題3)TrCBM1と多種のリグニンサンプルとの網羅的解析を行い、多様なリグニン誘導体に普遍的に適用できる相互作用メカニズムの提唱を目指す。リグニンオリゴマーモデルを用いた解析では5-5結合やβ-β結合など、β-O-4結合以外の結合がTrCBM1との相互作用に与える影響を評価できていないため、多種の単位間結合を有するリグニンモデルを合成し、TrCBM1との相互作用解析を二次元NMRにより行う。また、多種のリグニン誘導体を用いたTrCBM1との網羅的な相互作用解析も予定している。
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