2018 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム編集による養殖有用系統作出の効率化に向けた技術展開研究
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18J20434
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
岩泉 雅樹 東北大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | 養殖魚 / ゲノム編集 / 遺伝子導入 / 卵母細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
最近開発されたCRISPR/Cas9法は、水産増養殖の分野にも応用され始めている。本研究では、卵巣内卵母細胞にゲノム編集関連試薬を導入して、効率的にゲノム編集を行うことを目的としている。
これまでの実験で分泌型ルシフェラーゼをゼブラフィッシュの筋肉に導入すると血中に分泌され、卵母細胞に取り込まれ、受精卵で検出できることがわかっている。そこで、GFPに分泌シグナル（SP）、HiBiT tag (ルシフェラーゼ断片と結合するペプチドタグ)、核移行シグナル（NLS）、ビテロジェニン受容体結合配列(Vg)、His tagを付加したベクター（CMV-SP-EGFP-NLS-Vg）を作製した。同様にCMV-SP-Cas9-NLS-Vg を作製した。CMV-SP-EGFP-NLS-Vgを雌のセブラフィッシュの筋肉にエレクトロポレーションで導入したところ、筋肉ではGFP蛍光を確認できたものの、卵巣では確認できなかった。
そこで、Vgを付加し、FAM標識したペプチド (Vgペプチド)を受託合成した。さらに、無細胞合成系を用いて、GFPにVg、HiBiT tag、NLS、His tagを付加したキメラタンパク質（Vg-GFP）を合成した。VgペプチドおよびVg-GFPを雌のゼブラフィッシュに投与する実験を行った。Vgペプチド、Vg-GFPのいずれにおいても、卵巣内卵母細胞および受精卵の卵黄で蛍光が確認できた。このことから、卵母細胞にペプチドやタンパク質を導入することは可能であることがわかった。Vgペプチド、Vg-GFPは卵黄顆粒に封入されていると予想される。現在、エンドソーム破壊ペプチドなどを用いて卵黄顆粒を破壊し、Vgペプチド、Vg-GFPを細胞質に導入する方法を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
筋細胞からタンパク質を分泌させて卵母細胞に導入させるために2つのベクター（CMV-SP-EGFP-NLS-Vg、CMV-SP-Cas9-NLS-Vg）を作製した。エレクトロポレーションでゼブラフィッシュの筋肉にCMV-SP-EGFP-NLS-Vgを導入したところ、GFP蛍光は筋肉でのみ観察され、卵巣では確認できなかった。また、Vgペプチドを受託合成した。Vgペプチドをゼブラフィッシュに投与したところ、卵母細胞や受精卵の卵黄でFAM蛍光を確認することができた。さらに、無細胞合成系でVg-GFPを作製した。Vg-GFPをゼブラフィッシュに投与したころ、卵母細胞や受精卵の卵黄に導入できた。
ゼブラフィッシュのtyrosinase (メラニン合成酵素 )を標的とする化学合成のcrRNAおよびtracrRNA、Cas9タンパクを購入した。crRNAおよびtracrRNA、Cas9タンパクの複合体（RNP）を作製した。RNPのDNAの切断活性を評価するために、ゼブラフィッシュのtyrosinaseのPCR産物を用いて、in vitro cleavage assayを行ったところ、RNPのDNA切断活性を確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、VgペプチドとVg-GFPは受精卵に導入できているものの、卵黄に局在していて細胞質での局在は確認できていない。そこで、エンドソーム破壊ペプチドやクロロキンなどの薬剤を用いて卵黄顆粒を破壊して、VgペプチドやVg-GFPを細胞質に導入する方法を検討する。さらに、Vg-GFPのGFPの部分をCas9に置き換えたVg-Cas9を作製する。Vg-Cas9とcrRNA、tracrRNAを用いたRNP（Vg-RNP）を作製して、in vitro cleavage assayを行い、DNAの切断活性を評価する。その後、Vg-RNPと卵黄顆粒を破壊するための物質をゼブラフィッシュに投与して卵母細胞内でゲノム編集が可能か試験していく。Vg-RNPの卵母細胞への取り込みは、tracrRNAを標識しているATTO550の蛍光で判定する。また、抗Cas9抗体を用いた免疫学的手法を用いてRNPの導入の有無を判定する。さらに、Vg-RNPを導入した個体から受精卵を得てジェノタイピングを行い、変異導入の有無を判定する。
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Research Products
(1 results)
