2019 Fiscal Year Annual Research Report
腫瘍抑制因子ＳＴＫ１１によるデスレセプターシグナルのバランス制御機構の全容解明
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18J20440
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
土田 芽衣 東北大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | Apoptosis / STK11 / Fas / Kinase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Fasは細胞膜表面に発現している受容体で、Fasリガンドと結合して強力にアポトーシスを誘導することから、癌治療への応用が期待されている。しかし、多くの癌細胞がFas誘導性アポトーシスに耐性を示すことが判明し、Fasを応用した癌治療法は未だ確立されていない。本研究では、網羅的なRNAiスクリーニングを用いて、Fas誘導性アポトーシス促進因子として独自に同定したSTK11キナーゼによる、Fas誘導性アポトーシス感受性調節機構の解明を目的として研究を遂行した。
Fas誘導性アポトーシスは、ミトコンドリアを介する内部経路とミトコンドリアを介さない外部経路という、二つの経路によって誘導される。特に、外部経路はより効率的にアポトーシスを誘導できる経路であるとされるが、癌細胞では外部経路の活性化が起こりにくくなっていることが示され、癌細胞におけるアポトーシス耐性の一因であると考えられている。昨年度の解析により、外部経路の活性化には、STK11依存的な高分子複合体形成によるCaspase-8とCaspase-3の近接化が必要であることが示唆された。
今年度は、①STK11発現依存的にFasリガンド処置時形成される高分子複合体の解析と、②STK11が活性化するシグナル経路の同定を行った。高分子複合体の解析では、これまで行ってきた生化学的解析に加え、ショ糖密度勾配遠心法および免疫染色法により評価する実験系を構築し、高分子複合体の存在を明らかにした。また、アポトーシス関連因子群のノックアウトおよびノックインによって2種類の内部経路不全細胞を樹立し、Fas誘導性アポトーシスにおけるSTK11の機能的役割を解析した。その結果、内部経路不全細胞においてもSTK11はFas誘導性アポトーシスを促進することが判明し、STK11は外部経路の活性化によりFas誘導性アポトーシスを促進することが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、昨年度に引き続き、STK11によるキナーゼ活性非依存的なFas誘導性アポトーシス促進経路の解析を行った。昨年度の解析により、STK11は高分子複合体の形成を促進することでCaspase-8とCaspase-3を近接化し、外部経路を活性化することが示唆された。今年度は、STK11を再構築したHeLa細胞においてFasリガンド処置依存的に形成される高分子複合体を、ショ糖密度勾配遠心法および免疫染色法によって評価する実験系を構築し、高分子複合体の存在を明らかにした。しかし、複合体の分子実態は依然不明であるため、来年度も引き続き解析を進める。また、アポトーシス関連因子群のノックアウトおよびノックインによって2種類の内部経路不全細胞を樹立し解析した。その結果、STK11によるアポトーシス促進作用が内部経路不全細胞においても認められ、STK11は外部経路活性化によってFas誘導性アポトーシスを促進することが明らかになった。さらに予想外なことに、解析の過程で、STK11はFas下流で非典型的な機構によりミトコンドリア外膜の透過性を亢進することを発見した。検討の結果、STK11発現細胞において、ミトコンドリア外膜透過性の亢進に伴いミトコンドリアから細胞質に放出される因子の一つである、アポトーシス促進因子AIFがFas誘導性アポトーシスを促進することが判明し、STK11は外部経路の活性化に加え、非典型的な機構によるミトコンドリア外膜透過の亢進によってアポトーシスシグナルを増幅することが明らかとなった。よって、当該年度に遂行した、STK11によるキナーゼ活性非依存的なFas誘導性アポトーシス促進経路の解析は順調に進展したと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の研究から、STK11は高分子複合体の形成促進による外部経路の活性化と、非典型的な機構を介したミトコンドリア外膜の透過性亢進によるAIFの細胞質への放出によって、効率的にFas誘導性アポトーシスを促進することが明らかになった。次年度においては、高分子複合体の形成について、生化学的解析を中心とした詳細な解析を進め、その分子実態の解明を目指す。また、AIFは核に移行して細胞死を誘導する機能を有するため、Fasリガンド処置依存的なAIFの核移行に着目した解析を進める予定である。その後、高分子複合体形成による外部経路活性化機構とAIF依存的なアポトーシス促進機構の関与を明らかにするために、AIF欠損によるCaspase活性化への影響や、Caspase阻害によるAIF局在変化への影響などを、生化学的手法によって詳細に解析する。
一方、Fas誘導性アポトーシス促進能を有さないことが分かっている、癌組織で認められる一部の変異体STK11を再構築したHeLa細胞を用いて、高分子複合体形成能やAIF依存的なアポトーシス促進能を比較解析する。さらに、ゼノグラフトモデル（STK11を再構築したHeLa細胞を免疫不全マウスに移植）を用いた解析を行うことで、癌組織のアポトーシス耐性獲得における STK11の病理的役割を解析する。最終的にこれまでの結果の統合を図ることで、STK11によるFas誘導性アポトーシス促進機構の全容解明を目指す。
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Research Products
(6 results)
