2019 Fiscal Year Annual Research Report
マウス精巣特異的ｌｎｃＲＮＡクラスターの新規メカニズムと生理機能解析
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18J21075
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
大塚 海 北海道大学, 生命科学院, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | 精子形成 / lncRNA / 転写制御 / 翻訳制御 / miRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、新規に同定した長鎖非コードRNA(lncRNA)の機能解析を目的としている。lncRNA-aと仮称するこのlncRNAは精巣特異的に発現しており、生殖細胞の核と細胞質の両分画に局在を示しことが明らかとなっている。そこで2019年度の研究では、lncRNA-aの機能解析を試みた。
核内での機能解明のため、lncRNA-aが遺伝子の転写調節に寄与するかを検証したところ、lncRNA-aの転写によって近傍遺伝子の活性化を生じることが明らかとなった。また、この結果はlncRNA-a特異的なノックダウンによって失われた。
細胞質での機能解明を行った結果、lncRNA-aがmiRNAと相互作用することが示唆された。この結果はAgo2やDicer1といったmiRNA経路のノックダウンによって失われることを確認しており、加えてin vitro転写したlncRNA-aを用いたプルダウン実験によって、lncRNA-aと結合するmiRNAの同定を行った。
研究計画に沿って作製したlncRNA-aノックアウトマウスの表現型解析を行うことで、-/-ノックアウト個体において精巣重量が減少する傾向にあることを確認した。また、ノックアウト個体の精巣を用いて行ったRNA-seq解析によって、ステロイド産生に関わる遺伝子群の一部が変動を示すことを確認し、実際に個体の血中テストステロン濃度が変動を示すことを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究では、申請書に記載したlncRNA-aの研究において極めて順調に研究を遂行することに成功している。一方で、lncRNA-cと記載した産物が昨年度の研究によって下流遺伝子の転写開始点のバリアントの一種であることが明らかになり解析を中断したことに加え、lncRNA-bと記載した産物が両方向性に転写される計4種類のRNAから構成されていたことが明らかとなり、これらの解析は計画と比較して若干の遅れが生じている。これらの状況を鑑みたうえで、総合的にはおおむね順調に進展していると自己評価するに至った。
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| Strategy for Future Research Activity |
lncRNA-aの機能解析は、作製したノックアウトマウスの表現型解析ならびに遺伝子発現解析を行うことで生理機能を明らかにすることを試みる。また、ライディヒ細胞に由来する培養細胞株を利用してlncRNA-aの過剰発現を行うことで、lncRNA-aの作用機序を明らかにすることを試みる。
lncRNA-bの機能解析は、これまでの研究からコード領域がエンハンサー活性を持つこと、ならびにその標的遺伝子が明らかとなっているため、今後は精巣内における発現局在をin situ hybridizationによって明らかにすることを試みる。また、Ribotrap法を利用することで、lncRNA-bの複数の産物に結合するタンパク質の同定を試みる。
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