神経堤の特徴を呈する骨髄間葉系幹細胞塊を用いた歯胚再生の試み

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18J21198
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 大堀(森田) 悠美 東北大学, 歯学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2018-04-25 – 2021-03-31
• Keywords: 間葉系幹細胞（MSC） / 三次元培養 / 振盪培養 / 神経堤

Outline of Annual Research Achievements

骨髄間葉系幹細胞（MSCs）は高い自己複製能と多分化能を有しており，成体から得られる再生医療の細胞源として注目されてきた．さらに近年の研究では四肢骨髄MSCsは中胚葉由来の細胞のみならず，一部神経堤由来の細胞を含有することが報告されている．歯（歯原性間葉）・顎骨を含む頭頚部間葉系組織が神経堤由来であることはすでに報告されており，生体の発生過程を考慮し，神経堤由来の細胞が含まれる骨髄MSCsが歯・顎骨の再生療法に有用であることが考えられる．しかしながら接着継代培養を繰り返したMSCsは未分化性が失われることが報告されており，安定した幹細胞の性質維持が良好な再生療法に重要であると考えた．
我々はMSCsの未分化性を維持する新たな培養方法を探索し，一定条件下での浮遊振盪培養によって高い未分化性を維持するMSCs細胞塊を得ることに成功した．MSCs細胞塊は骨・軟骨・脂肪への分化能を認め，興味深いことに多分化能が低下した長期接着培養後のMSCsも浮遊振盪培養を用いてMSCs細胞塊を形成することにより，その分化能が回復することが示された．遺伝子発現解析において長期接着培養で低下する神経堤マーカー（Pax9）やMSCマーカー（PDGFRβ）がMSCs細胞塊において回復することが分かった．遺伝子定量解析において，MSCs細胞塊は接着培養MSCsと比較してMSCsマーカー（CD106）発現の有意な上昇を認めた．その上MSCs細胞塊を培養皿に接着させて培養することができ，MSC様細胞が細胞塊から遊走し，一つの細胞塊から多くのMSC様細胞を得ることが可能であることが示された．これらの結果により，我々の浮遊振盪培養法で形成されたMSCs細胞塊は高い幹細胞性を維持する細胞を供給することができ，さらに一度低下した幹細胞性を回復させることが可能であることが示唆された．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度はMSC細胞塊を形成する振盪培養条件の検討を行った．我々は当初マウスMSCsを用いて研究を行っていた．マウスMSCsを浮遊振盪培養下で細胞塊を形成することに成功し，細胞塊の骨・軟骨・脂肪への分化能を認めた．さらに長期接着培養後で未分化性が低下したマウスMSCsから細胞塊を形成することで，多分化能が回復することが示された．しかしながら遺伝子発現解析において接着細胞と細胞塊の明確な遺伝子発現の違いが認められず，振盪培養条件の検討に苦慮した．これよりヒトMSCsを用いた実験を開始した．ヒトMSCsからも同条件で細胞塊を得ることができ，マウス実験と同様にMSCs細胞塊の多分化能の維持・回復を認めた．一方，ヒトMSCsの遺伝子発現解析において長期接着培養で低下した神経堤マーカー（Sox9）とMSCマーカー（PDGFRβ）が細胞塊に形成することで発現が回復することが分かった．さらに興味深いことに，高い増殖能と分化能を有するMSCsに発現するCD106が接着培養MSCsと比較してMSCs細胞塊で有意に上昇していることが分かった．これらの結果により，MSCs細胞塊を形成する最適な振盪培養条件を確定することができ，今後細胞塊の詳細な性状解析を行っていく予定である．

Strategy for Future Research Activity

今年度の研究結果をふまえ，以下の研究を計画している．
①MSCs細胞塊の神経堤様の性質の検証：神経堤様の性質を有するMSCsが神経堤由来の歯・顎骨の再生療法に有利に働くと仮説を立てた．RT-PCRを用いた遺伝子発現解析において神経堤マーカーを探索してMSCs細胞塊の神経堤様性質を検証したところ，ヒトMSCs細胞塊では神経堤マーカーが回復していることが示された．そこでさらにMSCs細胞塊の神経堤系細胞（神経・グリア・平滑筋）への分化能を解析することで，MSCs細胞塊が神経堤様の性質を維持しているか検証していく．
②MSCs細胞塊の骨再生能の検証：MSCsはすでに顎骨の再生療法に応用されているが，患者間・施設間で臨床応用結果に差が生じることが問題となっていた．我々はMSCsの接着培養による未分化性の喪失がその原因の一つと考えた．我々が作製したMSCs細胞塊は安定した幹細胞の性質を有しており，三次元構造によってスキャフォールドフリーで移植することが可能であり，骨再生に有利に働くと考えている．そこでMSCs細胞塊と接着培養MSCsをラット頭蓋冠欠損モデルに移植することにより，それぞれの骨再生能を検証する．
③MSCs細胞塊の歯原性間葉としての能力の検証：得られた神経堤様MSCs細胞塊を歯原性間葉の細胞ソースとして応用し，器官原器法に準じて歯原性上皮細胞との結合を行い，歯胚構造が再生可能かを検証する．さらに我々の研究グループではiPS細胞から歯原性上皮細胞への誘導を同時に研究しており，最終的にはiPS細胞と我々の神経堤様MSCs細胞塊を結合し，歯胚再生が可能か検証する．この方法が成功すれば，歯原性上皮及び歯原性間葉の両組織が生体由来細胞から作成可能となったと証明できる．