2018 Fiscal Year Annual Research Report
TMX4を中心とする小胞体膜近傍での還元ネットワークの解明
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18J21570
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
堤 智香 京都産業大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | 小胞体 / 酸化還元 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
小胞体は膜および分泌タンパク質のフォールディングの場であり、PDIファミリータンパク質などの酸化還元酵素群に触媒され、ジスルフィド結合が導入される。また、小胞体内はサイトゾルと膜を隔てて酸化的な環境が一様に広がっていると考えられており、この酸化的な環境はタンパク質のジスルフィド結合形成に有利な環境だと言える。このように、これまで酸化的環境であり酸化反応の場として認識されてきた小胞体において、還元酵素ERdj5が同定され、その同定に伴い小胞体における還元反応の意義と重要性が証明されつつある。その一方、酸化的な小胞体において還元酵素がどのようにして還元力を獲得しているかは、未だ解明されておらず当該研究分野における重要な問題である。大腸菌ペリプラズム膜においては、サイトゾルからペリプラズム領域内へ膜を越えて電子伝達を行う経路が存在する。ペリプラズム領域は小胞体と同様に、膜および分泌タンパク質フォールディングの場であり、基質のジスルフィド結合形成が酸化還元酵素によって触媒されフォールディングが介助される。この基質のフォールディングに要する還元力は、DsbDを介して、サイトゾルのThioredoxin(Trx)から供給される。そこで、真核生物のおいても同様にサイトゾルTrxから供給される還元力を小胞体内腔で受容しているのではないかと考え、DsbD様の膜を越える電子伝達経路とその電子伝達を仲介する小胞体膜タンパク質の同定を最大の目的として研究を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大腸菌還元酵素DsbDと同様に、真核生物においてサイトゾルから小胞体への膜を越える電子伝達経路の解明を目的として研究を行っている。哺乳類細胞において、サイトゾルの主要な還元酵素Trxが小胞体へ還元力を供給する可能性を確かめるために、細胞分画によって小胞体画分を回収しTrxが小胞体膜上に結合するかを調べた。その結果、一部のTrxは小胞体画分に存在することが観察され、Trxが小胞体膜タンパク質に結合し電子を受け渡すことが示唆された。さらに、Trxへの還元力供与体であるTrxRの阻害剤オーラノフィンを用いて、PEGシフトアッセイを行い検証した。オーラノフィン処理によって、いくつかのPDIファミリータンパク質の酸化還元状態が酸化的に変化することが明らかになった。酸化的に変化したものの中から、小胞体膜局在型PDIファミリータンパク質であるTMX4がDsbDのように膜を越えた電子伝達を担うのではないかと推測した。TMX4のTrx様ドメインは還元活性を有することが既に報告されているが、TMX4が同定されて以来、その機能は未解明である。TMX4がTrxと結合し電子を受け取るかを調べるために、これまでTMX4がDsbD様の役割を果たす確かな証拠は得ることができなかった。TMX4以外の小胞体膜タンパク質が膜を越える還元力導入経路を形成することが示唆されたことから、小胞体膜上で電子伝達を仲介するようなTrx結合因子の探索を行った。従来、Trx相互作用因子の探索は、細胞抽出液に含まれる全タンパク質を候補として結合因子を同定したものがほとんどであったが、Trxが結合する小胞体膜タンパク質を同定するために哺乳類細胞から細胞分画によって小胞体画分を回収し、精製したTrxと反応させることで相互作用因子の同定を試みた。その結果、Trxと結合するいくつかの小胞体膜タンパク質を同定するに至った。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究によって、Trxが小胞体膜上に接近し小胞体内腔へ還元力を供給する可能性を示唆する結果を得た。また、PEGシフトアッセイによる小胞体の酸化還元状態の観察によって、Trxから供給される還元力を間接的に小胞体膜還元酵素TMX4が受け取っていることも確認された。Trxが小胞体へ電子伝達を行っていることが示唆されたことから、Trxが結合する小胞体膜タンパク質の探索を行い、小胞体膜タンパク質の結合パートナーを同定するに至った。これらの結果より、Trxが結合する小胞体膜タンパク質が、細胞内において実際にTrxから電子を受け取りTMX4などのPDIファミリータンパク質に受け渡しているかどうかをPEGシフトアッセイによって調べる。また、Trxの還元力を小胞体還元酵素TMX4が受け取っていることが確認された。しかし、TMX4は同定以来、還元酵素であることが明らかにされているにもかかわらず、小胞体内における機能や生物学的意義は未だ未解明のままである。そこで、TMX4がサイトゾルから供給される還元力を用いて、小胞体恒常性維持機構やタンパク質の品質管理に対してどのような形で寄与しているのかを明らかにする。具体的には、他グループよりTMX4がビタミンK還元酵素VKORに結合することが報告されていることから、TMX4が獲得した還元力を用いてVKORに触媒されるビタミンKの還元が促進されるかを検証する。さらに、これまでの知見より小胞体において還元酵素はタンパク質の正確なフォールディングと分解に関与することが多数報告されているため、サイトゾルからの還元力供給がそれらに貢献するかについても明らかにする。最終的には、これらの研究内容をまとめて、論文投稿を目指す。
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Research Products
(1 results)
